ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਸਮੱਗਰੀ: ਆਰ.ਐਨ.ਏ

ਕੁਆਂਟੀਟੇਟਿਵ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ PCR (RT-qPCR) ਇੱਕ ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਵਿਧੀ ਹੈ ਜੋ PCR ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਵਿੱਚ RNA ਦੀ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਸਮੱਗਰੀ ਦੇ ਤੌਰ 'ਤੇ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ।ਇਸ ਵਿਧੀ ਵਿੱਚ, ਕੁੱਲ RNA ਜਾਂ ਮੈਸੇਂਜਰ RNA (mRNA) ਨੂੰ ਪਹਿਲਾਂ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟੇਜ ਦੁਆਰਾ ਪੂਰਕ DNA (cDNA) ਵਿੱਚ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਇਸ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਇੱਕ qPCR ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਇੱਕ ਨਮੂਨੇ ਵਜੋਂ cDNA ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।RT-qPCR ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਈ ਤਰ੍ਹਾਂ ਦੇ ਅਣੂ ਜੀਵ ਵਿਗਿਆਨ ਐਪਲੀਕੇਸ਼ਨਾਂ ਵਿੱਚ ਕੀਤੀ ਗਈ ਹੈ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਜੀਨ ਸਮੀਕਰਨ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ, ਆਰਐਨਏ ਦਖਲ ਪ੍ਰਮਾਣਿਕਤਾ, ਮਾਈਕ੍ਰੋਏਰੇ ਪ੍ਰਮਾਣਿਕਤਾ, ਜਰਾਸੀਮ ਖੋਜ, ਜੈਨੇਟਿਕ ਟੈਸਟਿੰਗ, ਅਤੇ ਰੋਗ ਖੋਜ ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ।

RT-qPCR ਲਈ ਇੱਕ-ਕਦਮ ਅਤੇ ਦੋ-ਕਦਮ ਦੇ ਤਰੀਕੇ

RT-qPCR ਨੂੰ ਇੱਕ-ਕਦਮ ਜਾਂ ਦੋ-ਕਦਮ ਵਿਧੀ ਦੁਆਰਾ ਪੂਰਾ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਇੱਕ-ਕਦਮ RT-qPCR ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਅਤੇ ਪੀਸੀਆਰ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਨੂੰ ਜੋੜਦਾ ਹੈ, ਜਿਸ ਨਾਲ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟੇਸ ਅਤੇ ਡੀਐਨਏ ਪੋਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਇੱਕੋ ਬਫਰ ਹਾਲਤਾਂ ਵਿੱਚ ਇੱਕੋ ਟਿਊਬ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਨੂੰ ਪੂਰਾ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹਨ।ਇੱਕ-ਕਦਮ RT-qPCR ਲਈ ਸਿਰਫ਼ ਕ੍ਰਮ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਦੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ।ਦੋ-ਪੜਾਅ RT-qPCR ਵਿੱਚ, ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਅਤੇ ਪੀਸੀਆਰ ਐਂਪਲੀਫੀਕੇਸ਼ਨ ਦੋ ਟਿਊਬਾਂ ਵਿੱਚ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਅਨੁਕੂਲਿਤ ਬਫਰਾਂ, ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਸਥਿਤੀਆਂ, ਅਤੇ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਰਣਨੀਤੀਆਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਕੀਤੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ।

ਸੰਬੰਧਿਤ ਉਤਪਾਦ:

RT-qPCR Easyᵀᴹ (ਇੱਕ ਕਦਮ)-SYBR ਗ੍ਰੀਨ ਆਈ

RT-qPCR Easyᵀᴹ (ਇੱਕ ਕਦਮ)-Taqman

RT Easyᴹ I ਮਾਸਟਰ ਪ੍ਰੀਮਿਕਸ ਫਸਟ-ਸਟ੍ਰੈਂਡ CDNA ਸਿੰਥੇਸਿਸ ਲਈ

ਰੀਅਲ ਟਾਈਮ PCR Easyᵀᴹ-SYBR ਗ੍ਰੀਨ I ਕਿੱਟ

ਰੀਅਲ ਟਾਈਮ PCR Easyᵀᴹ-Takman

ਕੁੱਲ RNA ਅਤੇ mRNA ਦੀ ਚੋਣ

RT-qPCR ਪ੍ਰਯੋਗ ਨੂੰ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਕਰਦੇ ਸਮੇਂ, ਇਹ ਫੈਸਲਾ ਕਰਨਾ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਹੁੰਦਾ ਹੈ ਕਿ ਕੀ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਲਈ ਟੈਂਪਲੇਟ ਵਜੋਂ ਕੁੱਲ RNA ਜਾਂ ਸ਼ੁੱਧ mRNA ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਨੀ ਹੈ।ਹਾਲਾਂਕਿ mRNA ਥੋੜੀ ਉੱਚ ਸੰਵੇਦਨਸ਼ੀਲਤਾ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰਨ ਦੇ ਯੋਗ ਹੋ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਕੁੱਲ RNA ਅਜੇ ਵੀ ਅਕਸਰ ਵਰਤਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਇਸਦਾ ਕਾਰਨ ਇਹ ਹੈ ਕਿ ਕੁੱਲ RNA ਦਾ mRNA ਨਾਲੋਂ ਇੱਕ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਸਮੱਗਰੀ ਵਜੋਂ ਵਧੇਰੇ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਫਾਇਦਾ ਹੈ।ਪਹਿਲਾਂ, ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਲਈ ਘੱਟ ਸ਼ੁੱਧਤਾ ਕਦਮਾਂ ਦੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ ਟੈਂਪਲੇਟ ਦੀ ਬਿਹਤਰ ਮਾਤਰਾਤਮਕ ਰਿਕਵਰੀ ਅਤੇ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਸੈੱਲ ਨੰਬਰਾਂ ਦੇ ਨਤੀਜਿਆਂ ਦੇ ਬਿਹਤਰ ਸਧਾਰਨਕਰਨ ਨੂੰ ਯਕੀਨੀ ਬਣਾਉਂਦਾ ਹੈ।ਦੂਜਾ, ਇਹ mRNA ਸੰਸ਼ੋਧਨ ਪੜਾਅ ਤੋਂ ਬਚਦਾ ਹੈ, ਜੋ ਵੱਖ-ਵੱਖ mRNAs ਦੀਆਂ ਵੱਖੋ-ਵੱਖਰੀਆਂ ਰਿਕਵਰੀ ਦੇ ਕਾਰਨ ਤਿੱਖੇ ਨਤੀਜਿਆਂ ਦੀ ਸੰਭਾਵਨਾ ਤੋਂ ਬਚ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਕੁੱਲ ਮਿਲਾ ਕੇ, ਕਿਉਂਕਿ ਜ਼ਿਆਦਾਤਰ ਐਪਲੀਕੇਸ਼ਨਾਂ ਵਿੱਚ ਨਿਸ਼ਾਨਾ ਜੀਨ ਦੀ ਅਨੁਸਾਰੀ ਮਾਤਰਾ ਖੋਜ ਦੀ ਸੰਪੂਰਨ ਸੰਵੇਦਨਸ਼ੀਲਤਾ ਨਾਲੋਂ ਜ਼ਿਆਦਾ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਹੁੰਦੀ ਹੈ, ਕੁੱਲ RNA ਜ਼ਿਆਦਾਤਰ ਮਾਮਲਿਆਂ ਵਿੱਚ ਵਧੇਰੇ ਢੁਕਵਾਂ ਹੁੰਦਾ ਹੈ।

ਉਲਟਾ ਪ੍ਰਤੀਲਿਪੀ ਪ੍ਰਾਈਮਰ

ਦੋ-ਪੜਾਅ ਵਿਧੀ ਵਿੱਚ, cDNA ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਨੂੰ ਪ੍ਰਾਈਮ ਕਰਨ ਲਈ ਤਿੰਨ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਤਰੀਕਿਆਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਜਾ ਸਕਦੀ ਹੈ: ਓਲੀਗੋ(dT) ਪ੍ਰਾਈਮਰ, ਬੇਤਰਤੀਬ ਪ੍ਰਾਈਮਰ, ਜਾਂ ਕ੍ਰਮ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਪ੍ਰਾਈਮਰ।ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ, oligo(dT) ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਅਤੇ ਬੇਤਰਤੀਬ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਸੁਮੇਲ ਵਿੱਚ ਵਰਤੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ।ਇਹ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਟੈਂਪਲੇਟ mRNA ਸਟ੍ਰੈਂਡ ਨਾਲ ਜੋੜਦੇ ਹਨ ਅਤੇ ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਲਈ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਬਿੰਦੂ ਦੇ ਨਾਲ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟਸ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰਦੇ ਹਨ।

ਉਲਟਾ ਪ੍ਰਤੀਲਿਪੀ

ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟਸ ਇੱਕ ਐਨਜ਼ਾਈਮ ਹੈ ਜੋ ਡੀਐਨਏ ਦੇ ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਲਈ ਆਰਐਨਏ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦਾ ਹੈ।ਕੁਝ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟੇਸ ਵਿੱਚ RNase ਗਤੀਵਿਧੀ ਹੁੰਦੀ ਹੈ ਅਤੇ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ RNA-DNA ਹਾਈਬ੍ਰਿਡ ਸਟ੍ਰੈਂਡਾਂ ਵਿੱਚ RNA ਸਟ੍ਰੈਂਡਸ ਨੂੰ ਘਟਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਜੇ ਇਸ ਵਿੱਚ RNase ਐਨਜ਼ਾਈਮੈਟਿਕ ਗਤੀਵਿਧੀ ਨਹੀਂ ਹੈ, ਤਾਂ ਉੱਚ qPCR ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਲਈ RNaseH ਨੂੰ ਜੋੜਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਵਰਤੇ ਜਾਣ ਵਾਲੇ ਐਨਜ਼ਾਈਮਾਂ ਵਿੱਚ ਮੋਲੋਨੀ ਮਿਊਰੀਨ ਲਿਊਕੇਮੀਆ ਵਾਇਰਸ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟੇਜ ਅਤੇ ਏਵੀਅਨ ਮਾਈਲੋਬਲਾਸਟੋਮਾ ਵਾਇਰਸ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟੇਜ ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ।RT-qPCR ਲਈ, ਉੱਚ ਥਰਮੋਸਟੈਬਿਲਟੀ ਦੇ ਨਾਲ ਇੱਕ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟਸ ਚੁਣਨਾ ਆਦਰਸ਼ ਹੈ, ਤਾਂ ਜੋ ਉੱਚੇ ਤਾਪਮਾਨਾਂ 'ਤੇ cDNA ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕੇ, ਉੱਚ ਸੈਕੰਡਰੀ ਢਾਂਚੇ ਵਾਲੇ RNAs ਦੇ ਸਫਲ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਨੂੰ ਯਕੀਨੀ ਬਣਾਉਂਦੇ ਹੋਏ, ਪੂਰੀ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਦੌਰਾਨ ਉਹਨਾਂ ਦੀ ਪੂਰੀ ਗਤੀਵਿਧੀ ਨੂੰ ਕਾਇਮ ਰੱਖਦੇ ਹੋਏ, ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਉੱਚ cDNA ਉਪਜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ।

ਸੰਬੰਧਿਤ ਉਤਪਾਦ:

Foreasy M-MLV ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟੇਜ

ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟੇਜ ਦੀ RNase H ਗਤੀਵਿਧੀ

RNaseH ਆਰਐਨਏ-ਡੀਐਨਏ ਡੁਪਲੈਕਸਾਂ ਤੋਂ ਆਰਐਨਏ ਸਟ੍ਰੈਂਡਾਂ ਨੂੰ ਡੀਗਰੇਡ ਕਰਨ ਦੇ ਯੋਗ ਹੈ, ਜਿਸ ਨਾਲ ਡਬਲ-ਸਟ੍ਰੈਂਡਡ ਡੀਐਨਏ ਦੇ ਕੁਸ਼ਲ ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਦੀ ਆਗਿਆ ਮਿਲਦੀ ਹੈ।ਹਾਲਾਂਕਿ, ਲੰਬੇ mRNA ਨੂੰ ਟੈਂਪਲੇਟ ਦੇ ਤੌਰ 'ਤੇ ਵਰਤਦੇ ਸਮੇਂ, RNA ਸਮੇਂ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ ਘਟਾਇਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ cDNA ਨੂੰ ਕੱਟਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਇਸ ਲਈ, ਜੇ ਲੰਬੇ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟਾਂ ਦੇ ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਦੀ ਲੋੜ ਹੋਵੇ ਤਾਂ cDNA ਕਲੋਨਿੰਗ ਦੇ ਦੌਰਾਨ RNaseH ਗਤੀਵਿਧੀ ਨੂੰ ਘੱਟ ਤੋਂ ਘੱਟ ਕਰਨਾ ਅਕਸਰ ਫਾਇਦੇਮੰਦ ਹੁੰਦਾ ਹੈ।ਇਸਦੇ ਉਲਟ, RNase H ਗਤੀਵਿਧੀ ਦੇ ਨਾਲ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟਸ ਅਕਸਰ qPCR ਐਪਲੀਕੇਸ਼ਨਾਂ ਲਈ ਫਾਇਦੇਮੰਦ ਹੁੰਦੇ ਹਨ ਕਿਉਂਕਿ ਉਹ PCR ਦੇ ਪਹਿਲੇ ਚੱਕਰ ਦੌਰਾਨ RNA-DNA ਡੁਪਲੈਕਸ ਦੇ ਪਿਘਲਣ ਨੂੰ ਵਧਾਉਂਦੇ ਹਨ।

ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਡਿਜ਼ਾਈਨ

RT-qPCR ਵਿੱਚ qPCR ਕਦਮ ਲਈ ਵਰਤੇ ਜਾਣ ਵਾਲੇ PCR ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਨੂੰ ਆਦਰਸ਼ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਐਕਸੋਨ-ਐਕਸੋਨ ਜੰਕਸ਼ਨ ਨੂੰ ਫੈਲਾਉਣ ਲਈ ਤਿਆਰ ਕੀਤਾ ਜਾਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ, ਜਿੱਥੇ ਇੱਕ ਐਂਪਲੀਫੀਕੇਸ਼ਨ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਸੰਭਾਵੀ ਤੌਰ 'ਤੇ ਇੱਕ ਅਸਲ ਐਕਸੋਨ-ਇੰਟਰਨ ਸੀਮਾ ਨੂੰ ਫੈਲਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਕਿਉਂਕਿ ਇੰਟ੍ਰੋਨ-ਰੱਖਣ ਵਾਲੇ ਜੀਨੋਮਿਕ ਡੀਐਨਏ ਕ੍ਰਮ ਨੂੰ ਵਧਾਇਆ ਨਹੀਂ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਇਹ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਜੀਨੋਮਿਕ ਡੀਐਨਏ ਨੂੰ ਦੂਸ਼ਿਤ ਕਰਨ ਤੋਂ ਵਧੇ ਹੋਏ ਝੂਠੇ ਸਕਾਰਾਤਮਕ ਹੋਣ ਦੇ ਜੋਖਮ ਨੂੰ ਘਟਾਉਂਦਾ ਹੈ।

ਜੇਕਰ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਨੂੰ ਐਕਸੌਨ ਜਾਂ ਐਕਸੋਨ-ਐਕਸੋਨ ਸੀਮਾਵਾਂ ਨੂੰ ਵੱਖ ਕਰਨ ਲਈ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਨਹੀਂ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਤਾਂ ਜੀਨੋਮਿਕ ਡੀਐਨਏ ਗੰਦਗੀ ਨੂੰ ਹਟਾਉਣ ਲਈ RNase-ਮੁਕਤ DNase I ਜਾਂ dsDNase ਨਾਲ RNA ਨਮੂਨਿਆਂ ਦਾ ਇਲਾਜ ਕਰਨਾ ਜ਼ਰੂਰੀ ਹੋ ਸਕਦਾ ਹੈ।

RT-qPCR ਨਿਯੰਤਰਣ

ਇੱਕ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਨਕਾਰਾਤਮਕ ਨਿਯੰਤਰਣ (-RT ਨਿਯੰਤਰਣ) ਨੂੰ ਡੀਐਨਏ ਗੰਦਗੀ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾਉਣ ਲਈ ਸਾਰੇ RT-qPCR ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ ਕੀਤਾ ਜਾਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ (ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਪਿਛਲੀਆਂ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਤੋਂ ਜੀਨੋਮਿਕ ਡੀਐਨਏ ਜਾਂ ਪੀਸੀਆਰ ਉਤਪਾਦ)।ਇਸ ਨਿਯੰਤਰਣ ਵਿੱਚ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟੇਜ ਨੂੰ ਛੱਡ ਕੇ ਸਾਰੇ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਭਾਗ ਸ਼ਾਮਲ ਹੁੰਦੇ ਹਨ।ਕਿਉਂਕਿ ਇਸ ਨਿਯੰਤਰਣ ਨਾਲ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਨਹੀਂ ਹੁੰਦਾ, ਜੇਕਰ ਪੀਸੀਆਰ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਦੇਖਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਤਾਂ ਡੀਐਨਏ ਤੋਂ ਗੰਦਗੀ ਦੀ ਸੰਭਾਵਨਾ ਸਭ ਤੋਂ ਵੱਧ ਹੁੰਦੀ ਹੈ।