ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਆਧਾਰ (99% ਸਮੱਸਿਆਵਾਂ ਹੱਲ ਕੀਤੀਆਂ ਜਾ ਸਕਦੀਆਂ ਹਨ)
1. ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਦੀ ਲੰਬਾਈ: ਪਾਠ ਪੁਸਤਕ ਲਈ 15-30bp ਦੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ, ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਲਗਭਗ 20bp।ਅਸਲ ਸਥਿਤੀ ਖਾਸਤਾ ਨੂੰ ਯਕੀਨੀ ਬਣਾਉਣ ਲਈ 18-24bp ਹੋਣਾ ਬਿਹਤਰ ਹੈ, ਪਰ ਜਿੰਨਾ ਲੰਬਾ ਹੋਵੇਗਾ, ਬਹੁਤ ਲੰਬਾ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਵੀ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਨੂੰ ਘਟਾ ਦੇਵੇਗਾ, ਅਤੇ ਉਪਜ ਨੂੰ ਘਟਾ ਦੇਵੇਗਾ।
2. ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਸਪੈਨ: 200-500bp ਢੁਕਵਾਂ ਹੈ, ਅਤੇ ਫਰੈਗਮੈਂਟ ਨੂੰ ਖਾਸ ਹਾਲਤਾਂ ਵਿੱਚ 10kb ਤੱਕ ਵਧਾਇਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।
3. ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਬੇਸ: G+C ਦੀ ਸਮਗਰੀ 40-60% ਹੋਣੀ ਚਾਹੀਦੀ ਹੈ, ਬਹੁਤ ਘੱਟ G+C ਐਂਪਲੀਫੀਕੇਸ਼ਨ ਪ੍ਰਭਾਵ ਚੰਗਾ ਨਹੀਂ ਹੈ, ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ G+C ਗੈਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਬੈਂਡਾਂ ਨੂੰ ਦਿਸਣਾ ਆਸਾਨ ਹੈ।ATGC ਨੂੰ ਬੇਤਰਤੀਬ ਢੰਗ ਨਾਲ ਵੰਡਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, 5 ਤੋਂ ਵੱਧ ਪਿਊਰੀਨ ਜਾਂ ਪਾਈਰੀਮੀਡੀਨ ਨਿਊਕਲੀਓਟਾਈਡਸ ਦੇ ਕਲੱਸਟਰਾਂ ਤੋਂ ਬਚਦੇ ਹੋਏ।ਸਥਿਰਤਾ ਨੂੰ ਵਧਾਉਣ ਲਈ 5′ ਸਿਰੇ ਅਤੇ ਵਿਚਕਾਰਲੇ ਕ੍ਰਮਾਂ ਲਈ ਮਲਟੀ-gc, 3′ ਸਿਰੇ 'ਤੇ ਅਮੀਰ GC ਤੋਂ ਬਚੋ, ਆਖਰੀ 3 ਬੇਸਾਂ ਲਈ ਕੋਈ GC ਨਹੀਂ, ਜਾਂ ਆਖਰੀ 5 ਬੇਸਾਂ ਵਿੱਚੋਂ 3 ਲਈ ਕੋਈ GC ਨਹੀਂ ਹੈ।
4. ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਵਿੱਚ ਸੈਕੰਡਰੀ ਬਣਤਰ ਤੋਂ ਬਚੋ, ਅਤੇ ਦੋ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਵਿੱਚ ਪੂਰਕ ਹੋਣ ਤੋਂ ਬਚੋ, ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ 3' ਸਿਰੇ 'ਤੇ ਪੂਰਕ, ਨਹੀਂ ਤਾਂ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਡਾਇਮਰ ਬਣ ਜਾਣਗੇ ਅਤੇ ਗੈਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਐਂਪਲੀਫਾਈਡ ਬੈਂਡ ਬਣਾਏ ਜਾਣਗੇ।
5. ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਦੇ 3' ਸਿਰੇ 'ਤੇ ਅਧਾਰਾਂ, ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ ਆਖਰੀ ਅਤੇ ਅੰਤਮ ਅਧਾਰਾਂ, ਨੂੰ ਬਿਨਾਂ ਜੋੜੀ ਵਾਲੇ ਟਰਮੀਨਲ ਬੇਸਾਂ ਕਾਰਨ ਪੀਸੀਆਰ ਅਸਫਲਤਾ ਤੋਂ ਬਚਣ ਲਈ ਸਖਤੀ ਨਾਲ ਜੋੜਿਆ ਜਾਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ।
6. ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਵਿੱਚ ਉਚਿਤ ਕਲੀਵੇਜ ਸਾਈਟਾਂ ਹੁੰਦੀਆਂ ਹਨ ਜਾਂ ਜੋੜੀਆਂ ਜਾ ਸਕਦੀਆਂ ਹਨ, ਅਤੇ ਵਧੇ ਹੋਏ ਟੀਚੇ ਦੇ ਕ੍ਰਮ ਵਿੱਚ ਤਰਜੀਹੀ ਤੌਰ 'ਤੇ ਉਚਿਤ ਕਲੀਵੇਜ ਸਾਈਟਾਂ ਹੋਣੀਆਂ ਚਾਹੀਦੀਆਂ ਹਨ, ਜੋ ਕਿ ਕਲੀਵੇਜ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਜਾਂ ਅਣੂ ਕਲੋਨਿੰਗ ਲਈ ਬਹੁਤ ਲਾਹੇਵੰਦ ਹੈ।
7. ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਦੀ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ: ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਦਾ ਨਿਊਕਲੀਕ ਐਸਿਡ ਕ੍ਰਮ ਡੇਟਾਬੇਸ ਵਿੱਚ ਹੋਰ ਕ੍ਰਮਾਂ ਦੇ ਨਾਲ ਕੋਈ ਸਪੱਸ਼ਟ ਸਮਰੂਪ ਨਹੀਂ ਹੋਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ।
8. ਸਾਫਟਵੇਅਰ ਵਰਤਣਾ ਸਿੱਖੋ: PP5, Oligo6, DNAstar, Vector NTI, primer3 (ਇਹ ਆਨਲਾਈਨ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਵਧੀਆ ਕੰਮ ਕਰਦਾ ਹੈ)।
ਉਪਰੋਕਤ ਸਮੱਗਰੀ ਘੱਟੋ-ਘੱਟ 99% ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਸਮੱਸਿਆਵਾਂ ਨੂੰ ਹੱਲ ਕਰ ਸਕਦੀ ਹੈ।
ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਦੇ ਵੇਰਵਿਆਂ ਨੂੰ ਕੰਟਰੋਲ ਕਰੋ
1. ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਦੀ ਲੰਬਾਈ
ਆਮ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਦੀ ਲੰਬਾਈ 18~30 ਬੇਸ ਹੈ।ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਦੇ ਐਨੀਲਿੰਗ ਤਾਪਮਾਨ ਨੂੰ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨ ਵਾਲਾ ਸਭ ਤੋਂ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਕਾਰਕ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਦੀ ਲੰਬਾਈ ਹੈ।ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਦਾ ਐਨੀਲਿੰਗ ਤਾਪਮਾਨ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਚੁਣਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ (Tm ਮੁੱਲ -5℃), ਅਤੇ ਕੁਝ ਸਿੱਧੇ ਤੌਰ 'ਤੇ Tm ਮੁੱਲ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹਨ।ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਦੇ ਐਨੀਲਿੰਗ ਤਾਪਮਾਨ ਦੀ ਗਣਨਾ ਕਰਨ ਲਈ ਹੇਠਾਂ ਦਿੱਤੇ ਫਾਰਮੂਲੇ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਜਾ ਸਕਦੀ ਹੈ।
ਜਦੋਂ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਦੀ ਲੰਬਾਈ 20bp ਤੋਂ ਘੱਟ ਹੁੰਦੀ ਹੈ: [4(G+C)+2(A+T)]-5℃
ਜਦੋਂ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਦੀ ਲੰਬਾਈ 20bp ਤੋਂ ਵੱਧ ਹੁੰਦੀ ਹੈ: 62.3℃+0.41℃(%GC)-500/ਲੰਬਾਈ-5℃
ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਐਨੀਲਿੰਗ ਤਾਪਮਾਨ ਦੀ ਗਣਨਾ ਕਰਨ ਲਈ ਬਹੁਤ ਸਾਰੇ ਸੌਫਟਵੇਅਰ ਵੀ ਵਰਤੇ ਜਾ ਸਕਦੇ ਹਨ, ਗਣਨਾ ਦਾ ਸਿਧਾਂਤ ਵੱਖਰਾ ਹੋਵੇਗਾ, ਇਸ ਲਈ ਕਈ ਵਾਰ ਗਣਨਾ ਕੀਤੇ ਮੁੱਲ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਛੋਟਾ ਜਿਹਾ ਅੰਤਰ ਹੋ ਸਕਦਾ ਹੈ।PCR ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਨੂੰ ਅਨੁਕੂਲ ਬਣਾਉਣ ਲਈ, ਸਭ ਤੋਂ ਛੋਟੇ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਜੋ 54℃ ਤੋਂ ਘੱਟ ਨਾ ਹੋਣ ਵਾਲੇ ਐਨੀਲਿੰਗ ਤਾਪਮਾਨ ਨੂੰ ਯਕੀਨੀ ਬਣਾਉਂਦੇ ਹਨ, ਸਭ ਤੋਂ ਵਧੀਆ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਅਤੇ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਲਈ ਵਰਤੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ।
ਕੁੱਲ ਮਿਲਾ ਕੇ, ਹਰੇਕ ਵਾਧੂ ਨਿਊਕਲੀਓਟਾਈਡ ਲਈ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਦੀ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਚਾਰ ਗੁਣਾਂ ਨਾਲ ਵਧਦੀ ਹੈ, ਤਾਂ ਜੋ ਜ਼ਿਆਦਾਤਰ ਐਪਲੀਕੇਸ਼ਨਾਂ ਲਈ ਘੱਟੋ-ਘੱਟ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਦੀ ਲੰਬਾਈ 18 ਨਿਊਕਲੀਓਟਾਈਡ ਹੋਵੇ।ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਦੀ ਲੰਬਾਈ ਦੀ ਉਪਰਲੀ ਸੀਮਾ ਬਹੁਤ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਨਹੀਂ ਹੈ, ਮੁੱਖ ਤੌਰ 'ਤੇ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਨਾਲ ਸਬੰਧਤ ਹੈ।ਐਨਟ੍ਰੋਪੀ ਦੇ ਕਾਰਨ, ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਜਿੰਨਾ ਲੰਬਾ ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਡੀਐਨਏ ਪੌਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਨੂੰ ਬੰਨ੍ਹਣ ਲਈ ਇੱਕ ਸਥਿਰ ਡਬਲ-ਸਟੈਂਡਡ ਟੈਂਪਲੇਟ ਬਣਾਉਣ ਲਈ ਟੀਚੇ ਦੇ ਡੀਐਨਏ ਨਾਲ ਜੋੜਨ ਲਈ ਘੱਟ ਦਰ ਜਿਸ 'ਤੇ ਇਹ ਐਨੀਲ ਕਰਦਾ ਹੈ।
ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਨੂੰ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਕਰਨ ਲਈ ਸੌਫਟਵੇਅਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਸਮੇਂ, ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਦੀ ਲੰਬਾਈ ਬਦਲੇ ਵਿੱਚ TM ਮੁੱਲ ਦੁਆਰਾ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤੀ ਜਾ ਸਕਦੀ ਹੈ, ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਮਾਤਰਾਤਮਕ ਪੀਸੀਆਰ ਦੇ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਲਈ, TM=60℃ ਜਾਂ ਇਸ ਨੂੰ ਨਿਯੰਤਰਿਤ ਕੀਤਾ ਜਾਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ।
2.GC ਸਮੱਗਰੀ
ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਕ੍ਰਮਾਂ ਵਿੱਚ G+C ਦੀ ਸਮੱਗਰੀ 40%~60% ਹੁੰਦੀ ਹੈ, ਅਤੇ GC ਸਮੱਗਰੀ ਅਤੇ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਦੀ ਇੱਕ ਜੋੜਾ ਦੀ Tm ਮੁੱਲ ਦਾ ਤਾਲਮੇਲ ਹੋਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ।ਜੇਕਰ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਗੰਭੀਰ GC ਜਾਂ AT ਰੁਝਾਨ ਹੈ, ਤਾਂ A, T ਜਾਂ G ਅਤੇ C ਟੇਲ ਦੀ ਉਚਿਤ ਮਾਤਰਾ ਨੂੰ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਦੇ 5' ਸਿਰੇ ਵਿੱਚ ਜੋੜਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।
3. ਐਨੀਲਿੰਗ ਤਾਪਮਾਨ
ਐਨੀਲਿੰਗ ਤਾਪਮਾਨ ਅਨਚੇਨ ਤਾਪਮਾਨ ਨਾਲੋਂ 5 ℃ ਘੱਟ ਹੋਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ।ਜੇ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਬੇਸ ਦੀ ਗਿਣਤੀ ਛੋਟੀ ਹੈ, ਤਾਂ ਐਨੀਲਿੰਗ ਤਾਪਮਾਨ ਨੂੰ ਸਹੀ ਢੰਗ ਨਾਲ ਵਧਾਇਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਜੋ ਪੀਸੀਆਰ ਦੀ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਨੂੰ ਵਧਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਜੇ ਬੇਸਾਂ ਦੀ ਗਿਣਤੀ ਵੱਡੀ ਹੈ, ਤਾਂ ਐਨੀਲਿੰਗ ਤਾਪਮਾਨ ਨੂੰ ਉਚਿਤ ਢੰਗ ਨਾਲ ਘਟਾਇਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।4 ℃ ~ 6 ℃ ਦੇ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਦੇ ਇੱਕ ਜੋੜੇ ਵਿੱਚ ਐਨੀਲਿੰਗ ਤਾਪਮਾਨ ਦਾ ਅੰਤਰ PCR ਉਪਜ ਨੂੰ ਪ੍ਰਭਾਵਤ ਨਹੀਂ ਕਰੇਗਾ, ਪਰ ਆਦਰਸ਼ਕ ਤੌਰ ਤੇ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਦੀ ਇੱਕ ਜੋੜੇ ਦਾ ਐਨੀਲਿੰਗ ਤਾਪਮਾਨ ਇੱਕੋ ਜਿਹਾ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ 55 ℃ ~ 75 ℃ ਵਿਚਕਾਰ ਵੱਖ ਵੱਖ ਹੋ ਸਕਦਾ ਹੈ।
4. ਐਂਪਲੀਫੀਕੇਸ਼ਨ ਟੈਂਪਲੇਟ ਦੇ ਸੈਕੰਡਰੀ ਢਾਂਚੇ ਵਾਲੇ ਖੇਤਰ ਤੋਂ ਬਚੋ
ਐਂਪਲੀਫਾਈਡ ਫਰੈਗਮੈਂਟ ਦੀ ਚੋਣ ਕਰਦੇ ਸਮੇਂ ਟੈਂਪਲੇਟ ਦੇ ਸੈਕੰਡਰੀ ਢਾਂਚੇ ਵਾਲੇ ਖੇਤਰ ਤੋਂ ਬਚਣਾ ਸਭ ਤੋਂ ਵਧੀਆ ਹੈ।ਟੀਚੇ ਦੇ ਟੁਕੜੇ ਦੀ ਸਥਿਰ ਸੈਕੰਡਰੀ ਬਣਤਰ ਦੀ ਭਵਿੱਖਬਾਣੀ ਕੀਤੀ ਜਾ ਸਕਦੀ ਹੈ ਅਤੇ ਸੰਬੰਧਿਤ ਕੰਪਿਊਟਰ ਸੌਫਟਵੇਅਰ ਦੁਆਰਾ ਅਨੁਮਾਨ ਲਗਾਇਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ ਟੈਂਪਲੇਟ ਚੋਣ ਲਈ ਸਹਾਇਕ ਹੈ।ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਨਤੀਜੇ ਦਿਖਾਉਂਦੇ ਹਨ ਕਿ ਵਿਸਤਾਰ ਅਕਸਰ ਅਸਫਲ ਹੁੰਦਾ ਹੈ ਜਦੋਂ ਵਿਸਤਾਰ ਕੀਤੇ ਜਾਣ ਵਾਲੇ ਖੇਤਰ ਦੀ ਮੁਫਤ ਊਰਜਾ (△G) 58.6lkJ/mol ਤੋਂ ਘੱਟ ਹੁੰਦੀ ਹੈ।
5. ਟੀਚਾ ਡੀਐਨਏ ਨਾਲ ਮੇਲ ਨਹੀਂ ਖਾਂਦਾ
ਜਦੋਂ ਐਂਪਲੀਫਾਈਡ ਟੀਚਾ ਡੀਐਨਏ ਕ੍ਰਮ ਵੱਡਾ ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਤਾਂ ਇੱਕ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਟੀਚਾ ਡੀਐਨਏ ਦੇ ਕਈ ਹਿੱਸਿਆਂ ਨਾਲ ਬੰਨ੍ਹ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਕਈ ਬੈਂਡ ਦਿਖਾਈ ਦਿੰਦੇ ਹਨ।ਇਸ ਵਾਰ BLAST ਸੌਫਟਵੇਅਰ ਟੈਸਟਿੰਗ, ਵੈਬਸਾਈਟ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਨਾ ਜ਼ਰੂਰੀ ਹੈ:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.ਦੋ ਕ੍ਰਮ (bl2seq) ਨੂੰ ਅਲਾਈਨ ਚੁਣੋ।
ਜ਼ੋਨ 1 ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਕ੍ਰਮਾਂ ਨੂੰ ਪੇਸਟ ਕਰਨਾ ਅਤੇ ਜ਼ੋਨ 2 ਵਿੱਚ ਡੀਐਨਏ ਕ੍ਰਮਾਂ ਨੂੰ ਨਿਸ਼ਾਨਾ ਬਣਾਉਣਾ ਪਰਿਵਰਤਨਯੋਗ ਹੈ, ਅਤੇ BLAST ਪੂਰਕ, ਐਂਟੀਸੈਂਸ, ਅਤੇ ਹੋਰ ਸੰਭਾਵਨਾਵਾਂ ਦੀ ਗਣਨਾ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਇਸਲਈ ਉਪਭੋਗਤਾਵਾਂ ਨੂੰ ਇਹ ਧਿਆਨ ਦੇਣ ਦੀ ਜ਼ਰੂਰਤ ਨਹੀਂ ਹੈ ਕਿ ਕੀ ਦੋਵੇਂ ਚੇਨਾਂ ਸੈਂਸ ਚੇਨ ਹਨ।ਜੇਕਰ ਤੁਸੀਂ ਡੇਟਾਬੇਸ ਵਿੱਚ ਕ੍ਰਮ ਦਾ GI ਨੰਬਰ ਜਾਣਦੇ ਹੋ ਤਾਂ ਤੁਸੀਂ GI ਨੰਬਰ ਵੀ ਦਾਖਲ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹੋ, ਇਸ ਲਈ ਤੁਹਾਨੂੰ ਕ੍ਰਮ ਦੇ ਇੱਕ ਵੱਡੇ ਭਾਗ ਨੂੰ ਪੇਸਟ ਕਰਨ ਦੀ ਲੋੜ ਨਹੀਂ ਹੈ।ਅੰਤ ਵਿੱਚ, ਇਹ ਦੇਖਣ ਲਈ ਕਿ ਕੀ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਵਿੱਚ ਟੀਚੇ ਦੇ ਡੀਐਨਏ ਵਿੱਚ ਕਈ ਸਮਰੂਪ ਸਾਈਟਾਂ ਹਨ, 3 'ਤੇ ਅਲਾਈਨ ਕਲਿੱਕ ਕਰੋ।
6. ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਟਰਮੀਨਲ
ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਦਾ 3' ਸਿਰਾ ਉਹ ਥਾਂ ਹੈ ਜਿੱਥੇ ਐਕਸਟੈਂਸ਼ਨ ਸ਼ੁਰੂ ਹੁੰਦੀ ਹੈ, ਇਸਲਈ ਉੱਥੇ ਸ਼ੁਰੂ ਹੋਣ ਤੋਂ ਬੇਮੇਲਤਾ ਨੂੰ ਰੋਕਣਾ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਹੈ।3' ਦਾ ਅੰਤ 3 ਲਗਾਤਾਰ G ਜਾਂ C ਤੋਂ ਵੱਧ ਨਹੀਂ ਹੋਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ, ਕਿਉਂਕਿ ਇਹ G+C ਸੰਸ਼ੋਧਨ ਕ੍ਰਮ ਖੇਤਰ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਨੂੰ ਗਲਤੀ ਨਾਲ ਚਾਲੂ ਕਰ ਦੇਵੇਗਾ।3' ਸਿਰਾ ਕੋਈ ਸੈਕੰਡਰੀ ਢਾਂਚਾ ਨਹੀਂ ਬਣਾ ਸਕਦਾ, ਵਿਸ਼ੇਸ਼ PCR (AS-PCR) ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਨੂੰ ਛੱਡ ਕੇ, ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਦਾ 3′ ਸਿਰਾ ਬੇਮੇਲ ਨਹੀਂ ਹੋ ਸਕਦਾ।ਉਦਾਹਰਨ ਲਈ, ਜੇਕਰ ਏਨਕੋਡਿੰਗ ਖੇਤਰ ਨੂੰ ਵਧਾਇਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਤਾਂ ਕੋਡੋਨ ਦੀ ਤੀਜੀ ਸਥਿਤੀ 'ਤੇ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਦੇ 3' ਸਿਰੇ ਨੂੰ ਬੰਦ ਨਹੀਂ ਕੀਤਾ ਜਾਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ, ਕਿਉਂਕਿ ਕੋਡੋਨ ਦੀ ਤੀਜੀ ਸਥਿਤੀ ਡੀਜਨਰੇਟ ਹੋਣ ਦੀ ਸੰਭਾਵਨਾ ਹੈ, ਜੋ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਦੀ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਅਤੇ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਨੂੰ ਪ੍ਰਭਾਵਤ ਕਰੇਗੀ।ਅਨੇਕਸ਼ਨ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਸਮੇਂ, ਕੋਡੋਨ ਵਰਤੋਂ ਸਾਰਣੀ ਦਾ ਹਵਾਲਾ ਦਿਓ, ਜੈਵਿਕ ਤਰਜੀਹਾਂ ਵੱਲ ਧਿਆਨ ਦਿਓ, 3′ ਸਿਰੇ 'ਤੇ ਅਨੇਕਸ਼ਨ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਨਾ ਕਰੋ, ਅਤੇ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ (1uM-3uM) ਦੀ ਉੱਚ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ।
7. ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਦੀ ਸੈਕੰਡਰੀ ਬਣਤਰ
ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਵਿੱਚ ਆਪਣੇ ਆਪ ਵਿੱਚ ਪੂਰਕ ਕ੍ਰਮ ਨਹੀਂ ਹੋਣੇ ਚਾਹੀਦੇ ਹਨ, ਨਹੀਂ ਤਾਂ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਖੁਦ ਹੇਅਰਪਿਨ ਬਣਤਰਾਂ ਵਿੱਚ ਫੋਲਡ ਹੋ ਜਾਣਗੇ, ਅਤੇ ਇਹ ਸੈਕੰਡਰੀ ਢਾਂਚਾ ਸਟੀਰਿਕ ਰੁਕਾਵਟ ਦੇ ਕਾਰਨ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਅਤੇ ਟੈਂਪਲੇਟਾਂ ਦੀ ਬਾਈਡਿੰਗ ਨੂੰ ਪ੍ਰਭਾਵਤ ਕਰੇਗਾ।ਜੇ ਨਕਲੀ ਨਿਰਣੇ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ, ਤਾਂ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਦੇ ਨਿਰੰਤਰ ਪੂਰਕ ਅਧਾਰ 3bp ਤੋਂ ਵੱਧ ਨਹੀਂ ਹੋਣੇ ਚਾਹੀਦੇ।ਦੋ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਵਿਚਕਾਰ ਕੋਈ ਪੂਰਕਤਾ ਨਹੀਂ ਹੋਣੀ ਚਾਹੀਦੀ, ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ 3' ਸਿਰੇ ਦੇ ਪੂਰਕ ਓਵਰਲੈਪ ਤੋਂ ਪਰਹੇਜ਼ ਕੀਤਾ ਜਾਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ ਤਾਂ ਜੋ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਡਾਇਮਰਾਂ ਦੇ ਗਠਨ ਨੂੰ ਰੋਕਿਆ ਜਾ ਸਕੇ।ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਦੇ ਇੱਕ ਜੋੜੇ ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ 4 ਤੋਂ ਵੱਧ ਲਗਾਤਾਰ ਆਧਾਰਾਂ ਦੀ ਸਮਰੂਪਤਾ ਜਾਂ ਪੂਰਕਤਾ ਨਹੀਂ ਹੋਣੀ ਚਾਹੀਦੀ।
8. ਮਾਰਕਰ ਜਾਂ ਸਥਾਨ ਜੋੜੋ
5' ਅੰਤ ਦਾ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ 'ਤੇ ਬਹੁਤ ਘੱਟ ਪ੍ਰਭਾਵ ਹੁੰਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਇਸਲਈ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਨੂੰ ਪ੍ਰਭਾਵਿਤ ਕੀਤੇ ਬਿਨਾਂ ਸੋਧਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਪ੍ਰਾਈਮਰ 5 ਦੇ ਅੰਤ ਵਿੱਚ ਸੋਧ ਸ਼ਾਮਲ ਹੈ: ਐਂਜ਼ਾਈਮ ਪਾਬੰਦੀ ਸਾਈਟ ਨੂੰ ਜੋੜਨਾ;ਲੇਬਲ ਕੀਤੇ ਬਾਇਓਟਿਨ, ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ, ਡਿਗੌਕਸਿਨ, Eu3+, ਆਦਿ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਬਾਈਡਿੰਗ ਡੀਐਨਏ ਕ੍ਰਮ ਪੇਸ਼ ਕਰਦੇ ਹਨ;ਪਰਿਵਰਤਨ ਸਾਈਟਾਂ ਨੂੰ ਪੇਸ਼ ਕਰਨਾ, ਪਰਿਵਰਤਨ ਕ੍ਰਮਾਂ ਨੂੰ ਸ਼ਾਮਲ ਕਰਨਾ ਅਤੇ ਗੁੰਮ ਕਰਨਾ ਅਤੇ ਪ੍ਰਮੋਟਰ ਕ੍ਰਮਾਂ ਨੂੰ ਪੇਸ਼ ਕਰਨਾ, ਆਦਿ। ਵਾਧੂ ਅਧਾਰ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਦੀ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਨੂੰ ਘੱਟ ਜਾਂ ਘੱਟ ਪ੍ਰਭਾਵਿਤ ਕਰਨਗੇ ਅਤੇ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਡਾਇਮਰ ਬਣਨ ਦੀ ਸੰਭਾਵਨਾ ਨੂੰ ਵਧਾਉਂਦੇ ਹਨ, ਪਰ ਅਗਲੇ ਪੜਾਅ ਲਈ ਕੁਝ ਰਿਆਇਤਾਂ ਦਿੱਤੀਆਂ ਜਾਣੀਆਂ ਚਾਹੀਦੀਆਂ ਹਨ।ਵਾਧੂ ਕ੍ਰਮ ਜੋ ਟੀਚੇ ਦੇ ਕ੍ਰਮ 'ਤੇ ਮੌਜੂਦ ਨਹੀਂ ਹਨ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਪਾਬੰਦੀ ਸਾਈਟਾਂ ਅਤੇ ਪ੍ਰਮੋਟਰ ਕ੍ਰਮ, ਨੂੰ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਨੂੰ ਪ੍ਰਭਾਵਿਤ ਕੀਤੇ ਬਿਨਾਂ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਦੇ 5′ ਸਿਰੇ ਵਿੱਚ ਜੋੜਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਇਹ ਕ੍ਰਮ ਪ੍ਰਾਈਮਰ Tm ਮੁੱਲਾਂ ਦੀ ਗਣਨਾ ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ ਨਹੀਂ ਕੀਤੇ ਗਏ ਹਨ, ਪਰ ਪੂਰਕਤਾ ਅਤੇ ਅੰਦਰੂਨੀ ਸੈਕੰਡਰੀ ਢਾਂਚੇ ਲਈ ਟੈਸਟ ਕੀਤੇ ਜਾਣੇ ਚਾਹੀਦੇ ਹਨ।
9. ਸਬਕਲੋਨ
ਜ਼ਿਆਦਾਤਰ ਸਮਾਂ, ਪੀਸੀਆਰ ਸਿਰਫ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਕਲੋਨਿੰਗ ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਫਿਰ ਸਾਨੂੰ ਟੀਚੇ ਦੇ ਟੁਕੜੇ ਨੂੰ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਵੈਕਟਰਾਂ ਵਿੱਚ ਸਬਕਲੋਨ ਕਰਨ ਦੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ, ਇਸ ਲਈ ਸਾਨੂੰ ਪੀਸੀਆਰ ਪੜਾਅ ਵਿੱਚ ਅਗਲੇ ਓਪਰੇਸ਼ਨ ਲਈ ਵਾਧੂ ਬੇਸ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਕਰਨ ਦੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ।
ਸਬਕਲੋਨਿੰਗ ਲਈ ਤਿਆਰ ਕੀਤੇ ਗਏ ਕੁਝ ਕ੍ਰਮ ਹੇਠਾਂ ਦਿੱਤੇ ਗਏ ਹਨ।
ਪਾਬੰਦੀ endonuclease ਪਾਬੰਦੀ ਸਾਈਟ ਨੂੰ ਸ਼ਾਮਿਲ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ
ਐਨਜ਼ਾਈਮ ਪਾਬੰਦੀ ਸਾਈਟਾਂ ਨੂੰ ਜੋੜਨਾ ਪੀਸੀਆਰ ਉਤਪਾਦਾਂ ਨੂੰ ਸਬਕਲੋਨ ਕਰਨ ਲਈ ਸਭ ਤੋਂ ਵੱਧ ਵਰਤਿਆ ਜਾਣ ਵਾਲਾ ਤਰੀਕਾ ਹੈ।ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਕਲੀਵੇਜ ਸਾਈਟ ਛੇ ਬੇਸ ਹੁੰਦੀ ਹੈ, ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ ਕਲੀਵੇਜ ਸਾਈਟ ਦੇ 5 'ਅੰਤ ਨੂੰ 2 ~ 3 ਸੁਰੱਖਿਆ ਅਧਾਰਾਂ ਨੂੰ ਜੋੜਨ ਦੀ ਜ਼ਰੂਰਤ ਹੁੰਦੀ ਹੈ.ਹਾਲਾਂਕਿ, ਵੱਖ-ਵੱਖ ਐਨਜ਼ਾਈਮਾਂ ਦੁਆਰਾ ਲੋੜੀਂਦੇ ਸੁਰੱਖਿਆ ਆਧਾਰਾਂ ਦੀ ਗਿਣਤੀ ਵੱਖਰੀ ਹੁੰਦੀ ਹੈ।ਉਦਾਹਰਨ ਲਈ, SalⅠ ਨੂੰ ਕਿਸੇ ਸੁਰੱਖਿਆ ਆਧਾਰ ਦੀ ਲੋੜ ਨਹੀਂ ਹੈ, EcoRⅤ ਨੂੰ 1 ਸੁਰੱਖਿਆ ਆਧਾਰ ਦੀ ਲੋੜ ਹੈ, NotⅠ ਨੂੰ 2 ਸੁਰੱਖਿਆ ਆਧਾਰਾਂ ਦੀ ਲੋੜ ਹੈ, ਅਤੇ Hind Ⅲ ਨੂੰ 3 ਸੁਰੱਖਿਆ ਆਧਾਰਾਂ ਦੀ ਲੋੜ ਹੈ।
LIC ਪੂਛ ਜੋੜਦਾ ਹੈ
LIC ਦਾ ਪੂਰਾ ਨਾਮ Ligation-Independent cloning ਹੈ, ਇੱਕ ਕਲੋਨਿੰਗ ਵਿਧੀ ਜੋ Navogen ਦੁਆਰਾ ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ pET ਵੈਕਟਰ ਦੇ ਹਿੱਸੇ ਲਈ ਖੋਜੀ ਗਈ ਹੈ।LIC ਵਿਧੀ ਦੁਆਰਾ ਤਿਆਰ ਕੀਤੇ ਗਏ ਪੀਈਟੀ ਕੈਰੀਅਰ ਵਿੱਚ ਗੈਰ-ਪੂਰਕ 12-15 ਬੇਸ ਸਿੰਗਲ ਸਟ੍ਰੈਂਡ ਸਟਿੱਕੀ ਸਿਰੇ ਹੁੰਦੇ ਹਨ, ਜੋ ਟਾਰਗੇਟ ਇਨਸਰਟ ਫਰੈਗਮੈਂਟ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰੀ ਸਟਿੱਕੀ ਸਿਰੇ ਦੇ ਪੂਰਕ ਹੁੰਦੇ ਹਨ।ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਦੇ ਉਦੇਸ਼ਾਂ ਲਈ, ਸ਼ਾਮਲ ਕੀਤੇ ਗਏ ਟੁਕੜੇ ਦਾ ਪ੍ਰਾਈਮਰ 5′ ਕ੍ਰਮ LIC ਵੈਕਟਰ ਦੇ ਪੂਰਕ ਹੋਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ।T4 DNA ਪੌਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਦੀ 3′→5′ ਐਕਸਟਰੈਕਟ ਗਤੀਵਿਧੀ ਥੋੜ੍ਹੇ ਸਮੇਂ ਬਾਅਦ ਸੰਮਿਲਿਤ ਕੀਤੇ ਟੁਕੜੇ 'ਤੇ ਇੱਕ ਸਿੰਗਲ ਸਟ੍ਰੈਂਡ ਸਟਿੱਕੀ ਸਿਰੇ ਨੂੰ ਬਣਾ ਸਕਦੀ ਹੈ।ਕਿਉਂਕਿ ਉਤਪਾਦ ਸਿਰਫ ਤਿਆਰ ਕੀਤੇ ਸੰਮਿਲਿਤ ਟੁਕੜੇ ਅਤੇ ਵੈਕਟਰ ਦੇ ਆਪਸੀ ਐਨੀਲਿੰਗ ਤੋਂ ਬਣਾਇਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਇਹ ਵਿਧੀ ਬਹੁਤ ਤੇਜ਼ ਅਤੇ ਕੁਸ਼ਲ ਹੈ, ਅਤੇ ਇਹ ਨਿਰਦੇਸ਼ਿਤ ਕਲੋਨਿੰਗ ਹੈ।
ਨਿਰਦੇਸ਼ਿਤ TA ਕਲੋਨ ਐਡ ਟੇਲ
ਟੀਏ ਕਲੋਨਿੰਗ ਇੱਕ ਵੈਕਟਰ ਵਿੱਚ ਟੁਕੜੇ ਨੂੰ ਨਿਸ਼ਾਨਾ ਬਣਾਉਣ ਵਿੱਚ ਅਸਮਰੱਥ ਸੀ, ਇਸ ਲਈ ਬਾਅਦ ਵਿੱਚ ਇਨਵਿਟ੍ਰੋਜਨ ਨੇ ਇੱਕ ਵੈਕਟਰ ਪੇਸ਼ ਕੀਤਾ ਜੋ ਕਲੋਨਿੰਗ ਨੂੰ ਨਿਸ਼ਾਨਾ ਬਣਾ ਸਕਦਾ ਸੀ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਸਿਰੇ 'ਤੇ ਚਾਰ ਪ੍ਰਮੁੱਖ ਆਧਾਰ GTGGS ਸ਼ਾਮਲ ਸਨ।ਇਸ ਲਈ, ਪੀਸੀਆਰ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਦੇ ਡਿਜ਼ਾਇਨ ਵਿੱਚ, ਪੂਰਕ ਕ੍ਰਮਾਂ ਨੂੰ ਉਸ ਅਨੁਸਾਰ ਜੋੜਿਆ ਜਾਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ, ਤਾਂ ਜੋ ਟੁਕੜਿਆਂ ਨੂੰ "ਮੁਖੀ" ਬਣਾਇਆ ਜਾ ਸਕੇ।
ਜੇਕਰ ਤੁਹਾਡੇ ਕੋਲ ਸਮਾਂ ਘੱਟ ਹੈ, ਤਾਂ ਤੁਸੀਂ ਵੈਕਟਰ ਦੇ ਨਾਲ ਜੀਨ ਨੂੰ ਜੋੜ ਕੇ, ਸਿੱਧੇ ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਦੀ ਕੋਸ਼ਿਸ਼ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹੋ, ਜਿਸ ਨੂੰ ਅਸੀਂ ਮਿਊਜ਼ੀਕਲਿਸਟਾਂ ਵਿੱਚ ET ਜੀਨ ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਕਹਿੰਦੇ ਹਾਂ।
D. ਇਨ-ਫਿਊਜ਼ਨ ਕਲੋਨਿੰਗ ਵਿਧੀ
ਕੋਈ ligase ਦੀ ਲੋੜ ਨਹੀਂ, ਕੋਈ ਲੰਬੀ ਪ੍ਰਤੀਕਿਰਿਆ ਦੀ ਲੋੜ ਨਹੀਂ।ਜਦੋਂ ਤੱਕ ਲੀਨੀਅਰਾਈਜ਼ਡ ਵੈਕਟਰ ਦੇ ਦੋਵਾਂ ਸਿਰਿਆਂ 'ਤੇ ਇੱਕ ਕ੍ਰਮ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਦੇ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਵਿੱਚ ਪੇਸ਼ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਫਿਰ ਪੀਸੀਆਰ ਉਤਪਾਦ ਅਤੇ ਲੀਨੀਅਰਾਈਜ਼ਡ ਵੈਕਟਰ ਨੂੰ BSA ਵਾਲੇ ਇਨ-ਫਿਊਜ਼ਨ ਐਂਜ਼ਾਈਮ ਘੋਲ ਵਿੱਚ ਜੋੜਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਅੱਧੇ ਘੰਟੇ ਲਈ ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ ਰੱਖਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਪਰਿਵਰਤਨ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਇਹ ਵਿਧੀ ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ ਵੱਡੀ ਮਾਤਰਾ ਵਿੱਚ ਤਬਦੀਲੀ ਲਈ ਢੁਕਵੀਂ ਹੈ।
10. ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਨੂੰ ਮਿਲਾਓ
ਕਈ ਵਾਰ, ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਬਾਰੇ ਸਿਰਫ਼ ਸੀਮਤ ਕ੍ਰਮ ਜਾਣਕਾਰੀ ਹੀ ਜਾਣੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ।ਉਦਾਹਰਨ ਲਈ, ਜੇਕਰ ਸਿਰਫ਼ ਅਮੀਨੋ ਐਸਿਡ ਕ੍ਰਮ ਜਾਣਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਤਾਂ ਵਿਲੀਨ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਨੂੰ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਇੱਕ ਅਭੇਦ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਕ੍ਰਮਾਂ ਦਾ ਮਿਸ਼ਰਣ ਹੁੰਦਾ ਹੈ ਜੋ ਸਾਰੀਆਂ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਅਧਾਰ ਸੰਭਾਵਨਾਵਾਂ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਜੋ ਇੱਕ ਸਿੰਗਲ ਅਮੀਨੋ ਐਸਿਡ ਨੂੰ ਏਨਕੋਡ ਕਰਦੇ ਹਨ।ਵਿਸ਼ਿਸ਼ਟਤਾ ਨੂੰ ਵਧਾਉਣ ਲਈ, ਤੁਸੀਂ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਜੀਵਾਣੂਆਂ ਦੀਆਂ ਅਧਾਰ ਵਰਤੋਂ ਦੀਆਂ ਤਰਜੀਹਾਂ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ ਅਨੇਕਸ਼ਨ ਨੂੰ ਘਟਾਉਣ ਲਈ ਕੋਡੋਨ ਵਰਤੋਂ ਸਾਰਣੀ ਦਾ ਹਵਾਲਾ ਦੇ ਸਕਦੇ ਹੋ।ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਦੇ ਐਨੀਲਿੰਗ ਤਾਪਮਾਨ ਨੂੰ ਘਟਾਉਣ ਲਈ ਹਾਈਪੋਕਸੈਂਥਾਈਨ ਨੂੰ ਸਾਰੇ ਅਧਾਰਾਂ ਨਾਲ ਜੋੜਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਦੇ 3′ ਸਿਰੇ 'ਤੇ ਜੁੜੇ ਹੋਏ ਬੇਸਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਨਾ ਕਰੋ ਕਿਉਂਕਿ 3′ ਸਿਰੇ 'ਤੇ ਆਖਰੀ 3 ਬੇਸਾਂ ਦੀ ਐਨੀਲਿੰਗ ਗਲਤ ਸਾਈਟ 'ਤੇ ਪੀਸੀਆਰ ਸ਼ੁਰੂ ਕਰਨ ਲਈ ਕਾਫੀ ਹੈ।ਉੱਚ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ (1μM ਤੋਂ 3μM) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ ਕਿਉਂਕਿ ਬਹੁਤ ਸਾਰੇ ਅਨੇਕਸ਼ਨ ਮਿਸ਼ਰਣਾਂ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਨਿਸ਼ਾਨਾ ਟੈਂਪਲੇਟ ਲਈ ਖਾਸ ਨਹੀਂ ਹੁੰਦੇ ਹਨ।
ਪੀਸੀਆਰ ਕੱਚਾ ਮਾਲਕੰਟਰੋਲ
1. ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਮਾਤਰਾ
ਹਰੇਕ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਦੀ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ 0.1 ~ 1umol ਜਾਂ 10 ~ 100pmol ਹੈ।ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਦੀ ਸਭ ਤੋਂ ਘੱਟ ਮਾਤਰਾ ਨਾਲ ਲੋੜੀਂਦਾ ਨਤੀਜਾ ਪੈਦਾ ਕਰਨਾ ਬਿਹਤਰ ਹੈ.ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਦੀ ਉੱਚ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਬੇਮੇਲ ਅਤੇ ਗੈਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਦਾ ਕਾਰਨ ਬਣੇਗੀ, ਅਤੇ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਡਾਇਮਰ ਬਣਨ ਦੀ ਸੰਭਾਵਨਾ ਨੂੰ ਵਧਾਏਗੀ।
2. ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਇਕਾਗਰਤਾ
ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਦੀ ਇਕਾਗਰਤਾ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਨੂੰ ਪ੍ਰਭਾਵਿਤ ਕਰਦੀ ਹੈ।ਸਰਵੋਤਮ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ 0.1 ਅਤੇ 0.5μM ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਹੁੰਦਾ ਹੈ।ਉੱਚ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਗੈਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਉਤਪਾਦਾਂ ਨੂੰ ਵਧਾਉਣ ਦਾ ਕਾਰਨ ਬਣਦਾ ਹੈ।
3. ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਦਾ ਐਨੀਲਿੰਗ ਤਾਪਮਾਨ
ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਲਈ ਇੱਕ ਹੋਰ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਮਾਪਦੰਡ ਪਿਘਲਣ ਦਾ ਤਾਪਮਾਨ (ਟੀਐਮ) ਹੈ।ਇਹ ਉਹ ਤਾਪਮਾਨ ਹੁੰਦਾ ਹੈ ਜਦੋਂ 50% ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਅਤੇ ਪੂਰਕ ਕ੍ਰਮਾਂ ਨੂੰ ਡਬਲ-ਸਟ੍ਰੈਂਡਡ ਡੀਐਨਏ ਅਣੂਆਂ ਵਜੋਂ ਦਰਸਾਇਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।PCR ਐਨੀਲਿੰਗ ਤਾਪਮਾਨ ਸੈੱਟ ਕਰਨ ਲਈ Tm ਦੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ।ਆਦਰਸ਼ਕ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਐਨੀਲਿੰਗ ਤਾਪਮਾਨ ਟੀਚਾ ਕ੍ਰਮ ਦੇ ਨਾਲ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਦੀ ਪ੍ਰਭਾਵਸ਼ਾਲੀ ਐਨੀਲਿੰਗ ਨੂੰ ਯਕੀਨੀ ਬਣਾਉਣ ਲਈ ਕਾਫ਼ੀ ਘੱਟ ਹੈ, ਪਰ ਗੈਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਬਾਈਡਿੰਗ ਨੂੰ ਘਟਾਉਣ ਲਈ ਕਾਫ਼ੀ ਉੱਚਾ ਹੈ।55℃ ਤੋਂ 70℃ ਤੱਕ ਵਾਜਬ ਐਨੀਲਿੰਗ ਤਾਪਮਾਨ।ਐਨੀਲਿੰਗ ਤਾਪਮਾਨ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਦੇ Tm ਨਾਲੋਂ 5℃ ਘੱਟ ਸੈੱਟ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।
Tm ਸੈੱਟ ਕਰਨ ਲਈ ਕਈ ਫਾਰਮੂਲੇ ਹਨ, ਜੋ ਵਰਤੇ ਗਏ ਫਾਰਮੂਲੇ ਅਤੇ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਦੇ ਕ੍ਰਮ 'ਤੇ ਨਿਰਭਰ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਬਹੁਤ ਵੱਖਰੇ ਹੁੰਦੇ ਹਨ।ਕਿਉਂਕਿ ਜ਼ਿਆਦਾਤਰ ਫਾਰਮੂਲੇ ਇੱਕ ਅਨੁਮਾਨਿਤ Tm ਮੁੱਲ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰਦੇ ਹਨ, ਸਾਰੇ ਐਨੀਲਿੰਗ ਤਾਪਮਾਨ ਸਿਰਫ ਇੱਕ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਬਿੰਦੂ ਹੁੰਦੇ ਹਨ।ਕਈ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕਰਕੇ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਨੂੰ ਸੁਧਾਰਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ ਜੋ ਐਨੀਲਿੰਗ ਤਾਪਮਾਨ ਨੂੰ ਹੌਲੀ-ਹੌਲੀ ਵਧਾਉਂਦੇ ਹਨ।ਅਨੁਮਾਨਿਤ Tm-5℃ ਤੋਂ ਹੇਠਾਂ ਸ਼ੁਰੂ ਕਰੋ, ਅਤੇ ਹੌਲੀ ਹੌਲੀ ਐਨੀਲਿੰਗ ਤਾਪਮਾਨ ਨੂੰ 2℃ ਦੇ ਵਾਧੇ ਵਿੱਚ ਵਧਾਓ।ਉੱਚ ਐਨੀਲਿੰਗ ਤਾਪਮਾਨ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਡਾਈਮਰਾਂ ਅਤੇ ਗੈਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਉਤਪਾਦਾਂ ਦੇ ਗਠਨ ਨੂੰ ਘਟਾ ਦੇਵੇਗਾ।ਸਭ ਤੋਂ ਵਧੀਆ ਨਤੀਜਿਆਂ ਲਈ, ਦੋ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਦੇ ਲਗਭਗ Tm ਮੁੱਲ ਹੋਣੇ ਚਾਹੀਦੇ ਹਨ।ਜੇਕਰ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਜੋੜਿਆਂ ਦਾ Tm ਅੰਤਰ 5℃ ਤੋਂ ਵੱਧ ਹੈ, ਤਾਂ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਚੱਕਰ ਵਿੱਚ ਘੱਟ ਐਨੀਲਿੰਗ ਤਾਪਮਾਨ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਇੱਕ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਗਲਤ ਸ਼ੁਰੂਆਤ ਦਿਖਾਉਣਗੇ।ਜੇਕਰ ਦੋ ਪ੍ਰਾਈਮਰ Tm ਵੱਖ-ਵੱਖ ਹਨ, ਤਾਂ ਐਨੀਲਿੰਗ ਤਾਪਮਾਨ ਨੂੰ ਸਭ ਤੋਂ ਹੇਠਲੇ Tm ਤੋਂ 5℃ ਘੱਟ ਸੈੱਟ ਕਰੋ।ਵਿਕਲਪਕ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਨੂੰ ਵਧਾਉਣ ਲਈ, ਪੰਜ ਚੱਕਰ ਪਹਿਲਾਂ ਉੱਚੇ ਟੀਐਮ ਲਈ ਤਿਆਰ ਕੀਤੇ ਗਏ ਐਨੀਲਿੰਗ ਤਾਪਮਾਨਾਂ 'ਤੇ ਕੀਤੇ ਜਾ ਸਕਦੇ ਹਨ, ਇਸਦੇ ਬਾਅਦ ਹੇਠਲੇ ਟੀਐਮ ਲਈ ਤਿਆਰ ਕੀਤੇ ਗਏ ਐਨੀਲਿੰਗ ਤਾਪਮਾਨਾਂ' ਤੇ ਬਾਕੀ ਦੇ ਚੱਕਰ ਕੀਤੇ ਜਾ ਸਕਦੇ ਹਨ।ਇਹ ਮੰਜ਼ਿਲ ਟੈਂਪਲੇਟ ਦੀ ਇੱਕ ਅੰਸ਼ਕ ਕਾਪੀ ਨੂੰ ਤੰਗ ਹਾਲਤਾਂ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਨ ਦੀ ਆਗਿਆ ਦਿੰਦਾ ਹੈ।
4. ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਸ਼ੁੱਧਤਾ ਅਤੇ ਸਥਿਰਤਾ
ਕਸਟਮ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਦੀ ਮਿਆਰੀ ਸ਼ੁੱਧਤਾ ਜ਼ਿਆਦਾਤਰ PCR ਐਪਲੀਕੇਸ਼ਨਾਂ ਲਈ ਕਾਫ਼ੀ ਹੈ।ਡੀਸਾਲਟਿੰਗ ਦੁਆਰਾ ਬੈਂਜੋਇਲ ਅਤੇ ਆਈਸੋਬਿਊਟਿਲ ਸਮੂਹਾਂ ਨੂੰ ਹਟਾਉਣਾ ਘੱਟ ਹੈ ਅਤੇ ਇਸਲਈ ਪੀਸੀਆਰ ਵਿੱਚ ਦਖਲ ਨਹੀਂ ਦਿੰਦਾ।ਕੁਝ ਐਪਲੀਕੇਸ਼ਨਾਂ ਨੂੰ ਸਿੰਥੇਸਿਸ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਵਿੱਚ ਕਿਸੇ ਵੀ ਗੈਰ-ਪੂਰੀ-ਲੰਬਾਈ ਦੇ ਕ੍ਰਮ ਨੂੰ ਹਟਾਉਣ ਲਈ ਸ਼ੁੱਧਤਾ ਦੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ।ਇਹ ਕੱਟੇ ਹੋਏ ਕ੍ਰਮ ਇਸ ਲਈ ਵਾਪਰਦੇ ਹਨ ਕਿਉਂਕਿ ਡੀਐਨਏ ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਰਸਾਇਣ ਦੀ ਕੁਸ਼ਲਤਾ 100% ਨਹੀਂ ਹੈ।ਇਹ ਇੱਕ ਗੋਲਾਕਾਰ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਹੈ ਜੋ ਵਾਰ-ਵਾਰ ਰਸਾਇਣਕ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੀ ਹੈ ਕਿਉਂਕਿ ਹਰੇਕ ਅਧਾਰ ਨੂੰ 3′ ਤੋਂ 5′ ਤੱਕ DNA ਬਣਾਉਣ ਲਈ ਜੋੜਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਤੁਸੀਂ ਕਿਸੇ ਵੀ ਚੱਕਰ ਵਿੱਚ ਅਸਫਲ ਹੋ ਸਕਦੇ ਹੋ।ਲੰਬੇ ਪ੍ਰਾਈਮਰ, ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ 50 ਬੇਸਾਂ ਤੋਂ ਵੱਧ, ਕੱਟੇ ਹੋਏ ਕ੍ਰਮਾਂ ਦਾ ਇੱਕ ਵੱਡਾ ਅਨੁਪਾਤ ਹੁੰਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਉਹਨਾਂ ਨੂੰ ਸ਼ੁੱਧੀਕਰਨ ਦੀ ਲੋੜ ਹੋ ਸਕਦੀ ਹੈ।
ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਦੀ ਉਪਜ ਸਿੰਥੈਟਿਕ ਰਸਾਇਣ ਅਤੇ ਸ਼ੁੱਧਤਾ ਵਿਧੀ ਦੀ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਦੁਆਰਾ ਪ੍ਰਭਾਵਿਤ ਹੁੰਦੀ ਹੈ।ਬਾਇਓਫਾਰਮਾਸਿਊਟੀਕਲ ਕੰਪਨੀਆਂ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਸਾਇਟੋਲੋਜੀ ਅਤੇ ਸ਼ੇਂਗੌਂਗ, ਸਾਰੀਆਂ ਓਲੀਗੋਨਿਊਕਲੀਓਸਾਈਡ ਦੇ ਕੁੱਲ ਆਉਟਪੁੱਟ ਨੂੰ ਯਕੀਨੀ ਬਣਾਉਣ ਲਈ ਇੱਕ ਘੱਟੋ-ਘੱਟ OD ਯੂਨਿਟ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੀਆਂ ਹਨ।ਕਸਟਮ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਸੁੱਕੇ ਪਾਊਡਰ ਦੇ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਭੇਜੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ।TE ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਨੂੰ ਮੁੜ ਘੁਲਣਾ ਸਭ ਤੋਂ ਵਧੀਆ ਹੈ ਤਾਂ ਕਿ ਅੰਤਮ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ 100μM ਹੋਵੇ।TE ਡੀਓਨਾਈਜ਼ਡ ਪਾਣੀ ਨਾਲੋਂ ਬਿਹਤਰ ਹੈ ਕਿਉਂਕਿ ਪਾਣੀ ਦਾ pH ਅਕਸਰ ਤੇਜ਼ਾਬੀ ਹੁੰਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਓਲੀਗੋਨਿਊਕਲੀਓਸਾਈਡਜ਼ ਦੇ ਹਾਈਡੋਲਿਸਿਸ ਦਾ ਕਾਰਨ ਬਣਦਾ ਹੈ।
ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਦੀ ਸਥਿਰਤਾ ਸਟੋਰੇਜ ਦੀਆਂ ਸਥਿਤੀਆਂ 'ਤੇ ਨਿਰਭਰ ਕਰਦੀ ਹੈ।ਸੁੱਕੇ ਪਾਊਡਰ ਅਤੇ ਭੰਗ ਕੀਤੇ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਨੂੰ -20 ℃ 'ਤੇ ਸਟੋਰ ਕੀਤਾ ਜਾਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ।10μM ਤੋਂ ਵੱਧ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ 'ਤੇ TE ਵਿੱਚ ਭੰਗ ਕੀਤੇ ਗਏ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਨੂੰ 6 ਮਹੀਨਿਆਂ ਲਈ ਸਥਿਰਤਾ ਨਾਲ -20℃ ਵਿੱਚ ਸਟੋਰ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਪਰ ਸਿਰਫ ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ (15℃ ਤੋਂ 30℃) ਵਿੱਚ 1 ਹਫ਼ਤੇ ਤੋਂ ਘੱਟ ਲਈ ਸਟੋਰ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਸੁੱਕੇ ਪਾਊਡਰ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਨੂੰ ਘੱਟੋ-ਘੱਟ 1 ਸਾਲ ਲਈ -20 C ਅਤੇ ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ (15 C ਤੋਂ 30 C) 'ਤੇ 2 ਮਹੀਨਿਆਂ ਤੱਕ ਸਟੋਰ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।
5. ਪਾਚਕ ਅਤੇ ਉਹਨਾਂ ਦੀ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ
ਵਰਤਮਾਨ ਵਿੱਚ, ਵਰਤਿਆ ਗਿਆ Taq DNA ਪੋਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਮੂਲ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਕੋਲੀਫਾਰਮ ਬੈਕਟੀਰੀਆ ਦੁਆਰਾ ਸੰਸ਼ਲੇਸ਼ਿਤ ਜੀਨ ਇੰਜੀਨੀਅਰਿੰਗ ਐਂਜ਼ਾਈਮ ਹੈ।ਇੱਕ ਆਮ ਪੀਸੀਆਰ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਨੂੰ ਉਤਪ੍ਰੇਰਕ ਕਰਨ ਲਈ ਲੋੜੀਂਦੇ ਐਂਜ਼ਾਈਮ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਲਗਭਗ 2.5U ਹੈ (100ul ਦੀ ਕੁੱਲ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਵਾਲੀਅਮ ਦਾ ਹਵਾਲਾ ਦਿੰਦਾ ਹੈ)।ਜੇ ਇਕਾਗਰਤਾ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਹੈ, ਤਾਂ ਇਹ ਗੈਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਦੀ ਅਗਵਾਈ ਕਰ ਸਕਦੀ ਹੈ;ਜੇ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਬਹੁਤ ਘੱਟ ਹੈ, ਤਾਂ ਸਿੰਥੈਟਿਕ ਉਤਪਾਦ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਘਟਾਈ ਜਾਵੇਗੀ।
6. dNTP ਦੀ ਗੁਣਵੱਤਾ ਅਤੇ ਇਕਾਗਰਤਾ
dNTP ਦੀ ਗੁਣਵੱਤਾ ਪੀਸੀਆਰ ਪ੍ਰਸਾਰਣ ਦੀ ਇਕਾਗਰਤਾ ਅਤੇ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਨਾਲ ਨੇੜਿਓਂ ਸਬੰਧਤ ਹੈ।dNTP ਪਾਊਡਰ ਦਾਣੇਦਾਰ ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਇਸਦੀ ਪਰਿਵਰਤਨਸ਼ੀਲਤਾ ਇਸਦੀ ਜੈਵਿਕ ਗਤੀਵਿਧੀ ਨੂੰ ਗੁਆ ਦਿੰਦੀ ਹੈ ਜੇਕਰ ਇਹ ਗਲਤ ਢੰਗ ਨਾਲ ਸਟੋਰ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ।dNTP ਘੋਲ ਤੇਜ਼ਾਬੀ ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ 1M NaOH ਜਾਂ 1M Tris.HCL ਬਫਰ ਘੋਲ ਦੇ ਨਾਲ, ਇਸਦੇ PH ਨੂੰ 7.0 ~ 7.5, ਉਪ-ਪੈਕੇਜਿੰਗ ਦੀ ਛੋਟੀ ਮਾਤਰਾ, -20℃ 'ਤੇ ਜੰਮੀ ਹੋਈ ਸਟੋਰੇਜ ਨੂੰ ਅਨੁਕੂਲ ਕਰਨ ਲਈ, ਉੱਚ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਵਿੱਚ ਵਰਤਿਆ ਜਾਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ।ਮਲਟੀਪਲ ਫ੍ਰੀਜ਼-ਪਿਘਲਣਾ dNTP ਨੂੰ ਘਟਾ ਦੇਵੇਗਾ।ਪੀਸੀਆਰ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਵਿੱਚ, dNTP 50 ~ 200umol/L ਹੋਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ।ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਧਿਆਨ ਦਿੱਤਾ ਜਾਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ ਕਿ ਚਾਰ DNTPS ਦੀ ਇਕਾਗਰਤਾ ਬਰਾਬਰ ਹੋਣੀ ਚਾਹੀਦੀ ਹੈ (ਬਰਾਬਰ ਮੋਲ ਦੀ ਤਿਆਰੀ).ਜੇਕਰ ਉਹਨਾਂ ਵਿੱਚੋਂ ਕਿਸੇ ਇੱਕ ਦੀ ਇਕਾਗਰਤਾ ਬਾਕੀਆਂ (ਉੱਚ ਜਾਂ ਘੱਟ) ਤੋਂ ਵੱਖਰੀ ਹੈ, ਤਾਂ ਬੇਮੇਲ ਹੋਵੇਗਾ।ਬਹੁਤ ਘੱਟ ਇਕਾਗਰਤਾ ਪੀਸੀਆਰ ਉਤਪਾਦਾਂ ਦੀ ਪੈਦਾਵਾਰ ਨੂੰ ਘਟਾ ਦੇਵੇਗੀ।dNTP Mg2+ ਨਾਲ ਜੋੜ ਸਕਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਮੁਫਤ Mg2+ ਦੀ ਤਵੱਜੋ ਨੂੰ ਘਟਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।
7. ਟੈਂਪਲੇਟ (ਟਾਰਗੇਟ ਜੀਨ) ਨਿਊਕਲੀਕ ਐਸਿਡ
ਟੈਂਪਲੇਟ ਨਿਊਕਲੀਕ ਐਸਿਡ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਅਤੇ ਸ਼ੁੱਧਤਾ ਦੀ ਡਿਗਰੀ ਪੀਸੀਆਰ ਦੀ ਸਫਲਤਾ ਜਾਂ ਅਸਫਲਤਾ ਲਈ ਮੁੱਖ ਲਿੰਕਾਂ ਵਿੱਚੋਂ ਇੱਕ ਹੈ।ਰਵਾਇਤੀ ਡੀਐਨਏ ਸ਼ੁੱਧੀਕਰਨ ਵਿਧੀਆਂ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਨਮੂਨਿਆਂ ਨੂੰ ਹਜ਼ਮ ਕਰਨ ਅਤੇ ਨਿਪਟਾਉਣ ਲਈ SDS ਅਤੇ ਪ੍ਰੋਟੀਜ਼ ਕੇ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੀਆਂ ਹਨ।ਐਸਡੀਐਸ ਦੇ ਮੁੱਖ ਕੰਮ ਹਨ: ਸੈੱਲ ਝਿੱਲੀ 'ਤੇ ਲਿਪਿਡ ਅਤੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ ਭੰਗ ਕਰਨਾ, ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ ਝਿੱਲੀ ਦੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ ਭੰਗ ਕਰਕੇ ਸੈੱਲ ਝਿੱਲੀ ਨੂੰ ਨਸ਼ਟ ਕਰਨਾ, ਅਤੇ ਸੈੱਲ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਮਾਣੂ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ ਵੱਖ ਕਰਨਾ, ਐਸਡੀਐਸ ਪ੍ਰੋਟੀਨਾਂ ਨਾਲ ਵੀ ਜੋੜ ਸਕਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਪ੍ਰੀਪੀਟੇਟ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ;ਪ੍ਰੋਟੀਜ਼ ਕੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ ਹਾਈਡਰੋਲਾਈਜ਼ ਅਤੇ ਹਜ਼ਮ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ ਡੀਐਨਏ ਨਾਲ ਬੰਨ੍ਹੇ ਹੋਏ ਹਿਸਟੋਨ, ਅਤੇ ਫਿਰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਅਤੇ ਹੋਰ ਸੈੱਲ ਕੰਪੋਨੈਂਟਸ ਨੂੰ ਕੱਢਣ ਲਈ ਜੈਵਿਕ ਘੋਲਨ ਵਾਲਾ ਫਿਨੋਲ ਅਤੇ ਕਲੋਰੋਫਾਰਮ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਨਿਊਕਲੀਕ ਐਸਿਡ ਨੂੰ ਤੇਜ਼ ਕਰਨ ਲਈ ਈਥਾਨੌਲ ਜਾਂ ਆਈਸੋਪ੍ਰੋਪਾਈਲ ਅਲਕੋਹਲ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦਾ ਹੈ।ਕੱਢੇ ਗਏ ਨਿਊਕਲੀਕ ਐਸਿਡ ਨੂੰ ਪੀਸੀਆਰ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਲਈ ਨਮੂਨੇ ਵਜੋਂ ਵਰਤਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਆਮ ਕਲੀਨਿਕਲ ਖੋਜ ਦੇ ਨਮੂਨਿਆਂ ਲਈ, ਇੱਕ ਤੇਜ਼ ਅਤੇ ਸਰਲ ਵਿਧੀ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਘੁਲਣ, ਲਾਈਸੈਟ ਜਰਾਸੀਮ, ਪਾਚਨ ਅਤੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ ਕ੍ਰੋਮੋਸੋਮ ਤੋਂ ਮੁਕਤ ਟੀਚੇ ਵਾਲੇ ਜੀਨਾਂ ਤੱਕ ਹਟਾਉਣ ਲਈ, ਅਤੇ ਸਿੱਧੇ PCR ਪ੍ਰਸਾਰ ਲਈ ਵਰਤੀ ਜਾ ਸਕਦੀ ਹੈ।ਆਰਐਨਏ ਟੈਂਪਲੇਟ ਐਕਸਟਰੈਕਸ਼ਨ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ RNase ਨੂੰ ਆਰਐਨਏ ਨੂੰ ਘਟਣ ਤੋਂ ਰੋਕਣ ਲਈ guanidine isothiocyanate ਜਾਂ protease K ਵਿਧੀ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦਾ ਹੈ।
8.Mg2+ ਇਕਾਗਰਤਾ
Mg2+ ਦਾ PCR ਪ੍ਰਸਾਰਣ ਦੀ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਅਤੇ ਉਪਜ 'ਤੇ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਪ੍ਰਭਾਵ ਹੈ।ਆਮ ਪੀਸੀਆਰ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਵਿੱਚ, ਜਦੋਂ ਵੱਖ-ਵੱਖ dNTP ਦੀ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ 200umol/L ਹੁੰਦੀ ਹੈ, Mg2+ ਦੀ ਉਚਿਤ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ 1.5 ~ 2.0mmol/L ਹੁੰਦੀ ਹੈ।Mg2+ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਹੈ, ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਦੀ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਘਟਦੀ ਹੈ, ਗੈਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਹੁੰਦੀ ਹੈ, ਬਹੁਤ ਘੱਟ ਇਕਾਗਰਤਾ ਟਾਕ ਡੀਐਨਏ ਪੋਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਦੀ ਗਤੀਵਿਧੀ ਨੂੰ ਘਟਾ ਦੇਵੇਗੀ, ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਉਤਪਾਦਾਂ ਦੀ ਕਮੀ ਹੋਵੇਗੀ।
ਮੈਗਨੀਸ਼ੀਅਮ ਆਇਨ ਪੀਸੀਆਰ ਦੇ ਕਈ ਪਹਿਲੂਆਂ ਨੂੰ ਪ੍ਰਭਾਵਿਤ ਕਰਦੇ ਹਨ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਡੀਐਨਏ ਪੌਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਗਤੀਵਿਧੀ, ਜੋ ਉਪਜ ਨੂੰ ਪ੍ਰਭਾਵਿਤ ਕਰਦੀ ਹੈ;ਇਕ ਹੋਰ ਉਦਾਹਰਨ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਐਨੀਲਿੰਗ ਹੈ, ਜੋ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਨੂੰ ਪ੍ਰਭਾਵਿਤ ਕਰਦੀ ਹੈ।dNTP ਅਤੇ ਟੈਂਪਲੇਟ ਮੈਗਨੀਸ਼ੀਅਮ ਆਇਨ ਨਾਲ ਬੰਨ੍ਹਦੇ ਹਨ, ਐਨਜ਼ਾਈਮ ਗਤੀਵਿਧੀ ਲਈ ਲੋੜੀਂਦੇ ਮੁਫਤ ਮੈਗਨੀਸ਼ੀਅਮ ਆਇਨ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਨੂੰ ਘਟਾਉਂਦੇ ਹਨ।ਸਰਵੋਤਮ ਮੈਗਨੀਸ਼ੀਅਮ ਆਇਨ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਜੋੜਿਆਂ ਅਤੇ ਟੈਂਪਲੇਟਾਂ ਲਈ ਬਦਲਦਾ ਹੈ, ਪਰ 200μM dNTP ਨਾਲ ਇੱਕ ਆਮ ਪੀਸੀਆਰ ਸ਼ੁਰੂ ਹੋਣ ਵਾਲੀ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ 1.5mM ਹੈ (ਨੋਟ: ਰੀਅਲ-ਟਾਈਮ ਮਾਤਰਾਤਮਕ PCR ਲਈ, ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਪ੍ਰੋਬ ਦੇ ਨਾਲ 3 ਤੋਂ 5mm ਮੈਗਨੀਸ਼ੀਅਮ ਆਇਨ ਘੋਲ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ)।ਮੁਫਤ ਮੈਗਨੀਸ਼ੀਅਮ ਆਇਨਾਂ ਦੀ ਉੱਚ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਉਪਜ ਨੂੰ ਵਧਾਉਂਦੀ ਹੈ, ਪਰ ਨਾਲ ਹੀ ਗੈਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਵਾਧਾ ਵਧਾਉਂਦੀ ਹੈ ਅਤੇ ਵਫ਼ਾਦਾਰੀ ਨੂੰ ਘਟਾਉਂਦੀ ਹੈ।ਸਰਵੋਤਮ ਇਕਾਗਰਤਾ ਨੂੰ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨ ਲਈ, ਮੈਗਨੀਸ਼ੀਅਮ ਆਇਨ ਟਾਈਟਰੇਸ਼ਨ 1mM ਤੋਂ 3mM ਤੱਕ 0.5mM ਦੇ ਵਾਧੇ ਵਿੱਚ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।ਮੈਗਨੀਸ਼ੀਅਮ ਆਇਨ ਅਨੁਕੂਲਤਾ 'ਤੇ ਨਿਰਭਰਤਾ ਨੂੰ ਘਟਾਉਣ ਲਈ, ਪਲੈਟੀਨਮ ਟਾਕ ਡੀਐਨਏ ਪੋਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਜਾ ਸਕਦੀ ਹੈ।ਪਲੈਟੀਨਮ ਟਾਕ ਡੀਐਨਏ ਪੋਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਟਾਕ ਡੀਐਨਏ ਪੋਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਨਾਲੋਂ ਮੈਗਨੀਸ਼ੀਅਮ ਆਇਨ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਦੀ ਇੱਕ ਵਿਸ਼ਾਲ ਸ਼੍ਰੇਣੀ ਵਿੱਚ ਫੰਕਸ਼ਨ ਬਰਕਰਾਰ ਰੱਖਣ ਦੇ ਯੋਗ ਹੈ ਅਤੇ ਇਸ ਲਈ ਘੱਟ ਅਨੁਕੂਲਤਾ ਦੀ ਲੋੜ ਹੈ।
9. ਪੀਸੀਆਰ-ਪ੍ਰੋਮੋਟਿੰਗ ਐਡਿਟਿਵਜ਼
ਐਨੀਲਿੰਗ ਤਾਪਮਾਨ, ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਡਿਜ਼ਾਈਨ, ਅਤੇ ਮੈਗਨੀਸ਼ੀਅਮ ਆਇਨ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਦਾ ਅਨੁਕੂਲਤਾ ਜ਼ਿਆਦਾਤਰ ਟੈਂਪਲੇਟਾਂ ਦੇ ਬਹੁਤ ਹੀ ਖਾਸ ਪ੍ਰਸਾਰ ਲਈ ਕਾਫੀ ਹੈ;ਹਾਲਾਂਕਿ, ਕੁਝ ਟੈਂਪਲੇਟਾਂ, ਜਿਨ੍ਹਾਂ ਵਿੱਚ ਉੱਚ GC ਸਮੱਗਰੀ ਸ਼ਾਮਲ ਹੈ, ਨੂੰ ਵਾਧੂ ਉਪਾਵਾਂ ਦੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ।ਡੀਐਨਏ ਦੇ ਪਿਘਲਣ ਵਾਲੇ ਤਾਪਮਾਨ ਨੂੰ ਪ੍ਰਭਾਵਤ ਕਰਨ ਵਾਲੇ ਜੋੜ ਉਤਪਾਦ ਦੀ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਅਤੇ ਉਪਜ ਨੂੰ ਬਿਹਤਰ ਬਣਾਉਣ ਦਾ ਇੱਕ ਹੋਰ ਤਰੀਕਾ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰਦੇ ਹਨ।ਵਧੀਆ ਨਤੀਜਿਆਂ ਲਈ ਟੈਮਪਲੇਟ ਦੀ ਪੂਰੀ ਵਿਨਾਸ਼ਕਾਰੀ ਦੀ ਲੋੜ ਹੈ।
ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਸੈਕੰਡਰੀ ਬਣਤਰ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਬਾਈਡਿੰਗ ਅਤੇ ਐਂਜ਼ਾਈਮ ਐਕਸਟੈਂਸ਼ਨ ਨੂੰ ਰੋਕਦੀ ਹੈ।
ਪੀਸੀਆਰ ਐਡਿਟਿਵਜ਼, ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਫਾਰਮਾਮਾਈਡ, ਡੀਐਮਐਸਓ, ਗਲਾਈਸਰੀਨ, ਬੀਟੇਨ, ਅਤੇ ਪੀਸੀਆਰਐਕਸ ਐਨਹਾਂਸਰ ਸੋਲਿਊਸ਼ਨ ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ, ਪ੍ਰਸਾਰ ਨੂੰ ਵਧਾਉਂਦੇ ਹਨ।ਉਹਨਾਂ ਦੀ ਸੰਭਾਵੀ ਵਿਧੀ ਪਿਘਲਣ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ ਨੂੰ ਘਟਾਉਣਾ ਹੈ, ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਦੇ ਐਨੀਲਿੰਗ ਵਿੱਚ ਸਹਾਇਤਾ ਕਰਨਾ ਅਤੇ ਸੈਕੰਡਰੀ ਬਣਤਰ ਖੇਤਰ ਦੁਆਰਾ ਡੀਐਨਏ ਪੋਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਐਕਸਟੈਂਸ਼ਨ ਵਿੱਚ ਸਹਾਇਤਾ ਕਰਨਾ।PCRx ਹੱਲ ਦੇ ਹੋਰ ਫਾਇਦੇ ਹਨ।ਪਲੈਟੀਨਮ ਟਾਕ ਡੀਐਨਏ ਪੋਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਅਤੇ ਪਲੈਟੀਨਮ ਪੀਐਫਐਕਸ ਡੀਐਨਏ ਪੋਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਨਾਲ ਵਰਤੇ ਜਾਣ 'ਤੇ ਘੱਟੋ ਘੱਟ ਮੈਗਨੀਸ਼ੀਅਮ ਆਇਨ ਅਨੁਕੂਲਨ ਦੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ।ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ, ਤੀਜੀ ਪਹੁੰਚ, ਮੈਗਨੀਸ਼ੀਅਮ ਆਇਨ ਓਪਟੀਮਾਈਜੇਸ਼ਨ ਦੀ ਨਿਰਭਰਤਾ ਨੂੰ ਘਟਾਉਂਦੇ ਹੋਏ, ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਨੂੰ ਵਧਾਉਣ ਲਈ ਪਲੈਟੀਨਮ ਤਕਨੀਕ ਨੂੰ ਐਡਿਟਿਵ ਨਾਲ ਜੋੜਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਵਧੀਆ ਨਤੀਜਿਆਂ ਲਈ, ਐਡਿਟਿਵਜ਼ ਦੀ ਇਕਾਗਰਤਾ ਨੂੰ ਅਨੁਕੂਲਿਤ ਕੀਤਾ ਜਾਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ, ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ ਡੀਐਮਐਸਓ, ਫਾਰਮਾਮਾਈਡ, ਅਤੇ ਗਲਾਈਸਰੋਲ, ਜੋ ਕਿ ਟਾਕ ਡੀਐਨਏ ਪੋਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਨੂੰ ਰੋਕਦੇ ਹਨ।
10. ਗਰਮ ਸ਼ੁਰੂਆਤ
ਵਧੀਆ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਦੇ ਨਾਲ-ਨਾਲ ਪੀਸੀਆਰ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਨੂੰ ਬਿਹਤਰ ਬਣਾਉਣ ਲਈ ਹੌਟ ਸਟਾਰਟ ਪੀਸੀਆਰ ਸਭ ਤੋਂ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤਰੀਕਿਆਂ ਵਿੱਚੋਂ ਇੱਕ ਹੈ।ਹਾਲਾਂਕਿ ਟਾਕ ਡੀਐਨਏ ਪੋਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਦਾ ਸਰਵੋਤਮ ਲੰਬਾ ਤਾਪਮਾਨ 72 ℃ ਹੈ, ਪੋਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ ਕਿਰਿਆਸ਼ੀਲ ਰਹਿੰਦਾ ਹੈ।ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ, ਗੈਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਉਤਪਾਦ ਉਦੋਂ ਪੈਦਾ ਹੁੰਦੇ ਹਨ ਜਦੋਂ ਪੀਸੀਆਰ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਦੀ ਤਿਆਰੀ ਦੌਰਾਨ ਅਤੇ ਥਰਮਲ ਚੱਕਰ ਦੀ ਸ਼ੁਰੂਆਤ ਵਿੱਚ ਹੋਲਡਿੰਗ ਤਾਪਮਾਨ ਐਨੀਲਿੰਗ ਤਾਪਮਾਨ ਤੋਂ ਘੱਟ ਹੁੰਦਾ ਹੈ।ਇੱਕ ਵਾਰ ਬਣਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਇਹ ਗੈਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਉਤਪਾਦਾਂ ਨੂੰ ਪ੍ਰਭਾਵਸ਼ਾਲੀ ਢੰਗ ਨਾਲ ਵਧਾਇਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਹੌਟ-ਸਟਾਰਟ ਪੀਸੀਆਰ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਤੌਰ 'ਤੇ ਪ੍ਰਭਾਵਸ਼ਾਲੀ ਹੁੰਦਾ ਹੈ ਜਦੋਂ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਲਈ ਵਰਤੀਆਂ ਜਾਂਦੀਆਂ ਸਾਈਟਾਂ ਜੈਨੇਟਿਕ ਤੱਤਾਂ ਦੀ ਸਥਿਤੀ ਦੁਆਰਾ ਸੀਮਿਤ ਹੁੰਦੀਆਂ ਹਨ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਸਾਈਟ-ਨਿਰਦੇਸ਼ਿਤ ਪਰਿਵਰਤਨ, ਸਮੀਕਰਨ ਕਲੋਨਿੰਗ, ਜਾਂ ਡੀਐਨਏ ਇੰਜੀਨੀਅਰਿੰਗ ਲਈ ਵਰਤੇ ਜਾਂਦੇ ਜੈਨੇਟਿਕ ਤੱਤਾਂ ਦੀ ਉਸਾਰੀ ਅਤੇ ਹੇਰਾਫੇਰੀ।
ਟਾਕ ਡੀਐਨਏ ਪੋਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਦੀ ਗਤੀਵਿਧੀ ਨੂੰ ਸੀਮਿਤ ਕਰਨ ਦਾ ਇੱਕ ਆਮ ਤਰੀਕਾ ਬਰਫ਼ ਉੱਤੇ ਪੀਸੀਆਰ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਘੋਲ ਤਿਆਰ ਕਰਨਾ ਅਤੇ ਇਸਨੂੰ ਪਹਿਲਾਂ ਤੋਂ ਗਰਮ ਕੀਤੇ ਪੀਸੀਆਰ ਉਪਕਰਣ ਵਿੱਚ ਰੱਖਣਾ ਹੈ।ਇਹ ਵਿਧੀ ਸਧਾਰਨ ਅਤੇ ਸਸਤੀ ਹੈ, ਪਰ ਇਹ ਐਂਜ਼ਾਈਮ ਦੀ ਗਤੀਵਿਧੀ ਨੂੰ ਪੂਰਾ ਨਹੀਂ ਕਰਦੀ ਹੈ ਅਤੇ ਇਸਲਈ ਗੈਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਉਤਪਾਦਾਂ ਦੇ ਪ੍ਰਸਾਰ ਨੂੰ ਪੂਰੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਖਤਮ ਨਹੀਂ ਕਰਦੀ ਹੈ।
ਥਰਮਲ ਪ੍ਰਾਈਮਿੰਗ ਇੱਕ ਜ਼ਰੂਰੀ ਕੰਪੋਨੈਂਟ ਨੂੰ ਰੋਕ ਕੇ ਡੀਐਨਏ ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਵਿੱਚ ਦੇਰੀ ਕਰਦੀ ਹੈ ਜਦੋਂ ਤੱਕ ਪੀਸੀਆਰ ਯੰਤਰ ਵਿਨਾਸ਼ਕਾਰੀ ਤਾਪਮਾਨ ਤੱਕ ਨਹੀਂ ਪਹੁੰਚ ਜਾਂਦਾ।ਜ਼ਿਆਦਾਤਰ ਮੈਨੂਅਲ ਥਰਮਲ ਇਨੀਸ਼ੀਏਸ਼ਨ ਵਿਧੀਆਂ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਟਾਕ ਡੀਐਨਏ ਪੋਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਦੇ ਦੇਰੀ ਨਾਲ ਜੋੜਨਾ ਸ਼ਾਮਲ ਹੈ, ਬੋਝਲ ਹਨ, ਖਾਸ ਕਰਕੇ ਉੱਚ-ਥਰੂਪੁੱਟ ਐਪਲੀਕੇਸ਼ਨਾਂ ਲਈ।ਹੋਰ ਥਰਮਲ ਪ੍ਰਾਈਮਿੰਗ ਵਿਧੀਆਂ ਮੈਗਨੀਸ਼ੀਅਮ ਆਇਨਾਂ ਜਾਂ ਐਨਜ਼ਾਈਮਾਂ ਸਮੇਤ, ਜਾਂ ਟੈਂਪਲੇਟਸ ਅਤੇ ਬਫਰਾਂ ਵਰਗੇ ਰਿਐਕਟਿਵ ਕੰਪੋਨੈਂਟਸ ਨੂੰ ਸਰੀਰਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਅਲੱਗ ਕਰਨ ਲਈ ਜ਼ਰੂਰੀ ਕੰਪੋਨੈਂਟ ਨੂੰ ਜੋੜਨ ਲਈ ਮੋਮ ਦੀ ਢਾਲ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੀਆਂ ਹਨ।ਥਰਮਲ ਚੱਕਰ ਦੇ ਦੌਰਾਨ, ਮੋਮ ਦੇ ਪਿਘਲਣ ਦੇ ਨਾਲ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਭਾਗਾਂ ਨੂੰ ਛੱਡ ਦਿੱਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਮਿਲਾਇਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਮੈਨੂਅਲ ਹੌਟ ਸਟਾਰਟ ਵਿਧੀ ਦੀ ਤਰ੍ਹਾਂ, ਮੋਮ ਦੀ ਢਾਲ ਵਿਧੀ ਬੋਝਲ ਅਤੇ ਗੰਦਗੀ ਦੀ ਸੰਭਾਵਨਾ ਹੈ ਅਤੇ ਉੱਚ ਥ੍ਰੋਪੁੱਟ ਐਪਲੀਕੇਸ਼ਨਾਂ ਲਈ ਢੁਕਵੀਂ ਨਹੀਂ ਹੈ।
ਪਲੈਟੀਨਮ ਡੀਐਨਏ ਪੋਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਆਟੋਮੈਟਿਕ ਹਾਟ ਸਟਾਰਟ ਪੀਸੀਆਰ ਲਈ ਸੁਵਿਧਾਜਨਕ ਅਤੇ ਕੁਸ਼ਲ ਹੈ।ਪਲੈਟੀਨਮ ਟਾਕ ਡੀਐਨਏ ਪੋਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਵਿੱਚ ਟਾਕ ਡੀਐਨਏ ਪੋਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਦੇ ਵਿਰੁੱਧ ਮੋਨੋਕਲੋਨਲ ਐਂਟੀਬਾਡੀ ਦੇ ਨਾਲ ਮਿਲਾ ਕੇ ਰੀਕੌਂਬੀਨੈਂਟ ਟਾਕ ਡੀਐਨਏ ਪੋਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਸ਼ਾਮਲ ਹੁੰਦੇ ਹਨ।ਐਂਟੀਬਾਡੀਜ਼ ਪੀਸੀਆਰ ਦੁਆਰਾ ਲੰਬੇ ਸਮੇਂ ਤੱਕ ਤਾਪਮਾਨ ਰੱਖਣ ਦੇ ਦੌਰਾਨ ਐਨਜ਼ਾਈਮ ਦੀ ਗਤੀਵਿਧੀ ਨੂੰ ਰੋਕਣ ਲਈ ਤਿਆਰ ਕੀਤੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ।ਟਾਕ ਡੀਐਨਏ ਪੋਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਨੂੰ ਵਿਨਾਸ਼ਕਾਰੀ ਪੜਾਅ ਦੇ 94℃ ਇਨਸੂਲੇਸ਼ਨ ਦੇ ਦੌਰਾਨ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਵਿੱਚ ਜਾਰੀ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਪੂਰੀ ਪੋਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਗਤੀਵਿਧੀ ਨੂੰ ਬਹਾਲ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਥਰਮਲ ਸ਼ੁਰੂਆਤ ਲਈ ਰਸਾਇਣਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਸੋਧੇ Taq DNA ਪੋਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਦੇ ਉਲਟ, ਪਲੈਟੀਨਮ ਐਨਜ਼ਾਈਮ ਨੂੰ ਪੌਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਨੂੰ ਸਰਗਰਮ ਕਰਨ ਲਈ 94℃ (10 ਤੋਂ 15 ਮਿੰਟ) 'ਤੇ ਲੰਬੇ ਸਮੇਂ ਤੱਕ ਇਨਸੂਲੇਸ਼ਨ ਦੀ ਲੋੜ ਨਹੀਂ ਹੁੰਦੀ ਹੈ।ਪਲੈਟੀਨਮਟੈਕ ਡੀਐਨਏ ਪੋਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਦੇ ਨਾਲ, 90% ਟਾਕ ਡੀਐਨਏ ਪੋਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਗਤੀਵਿਧੀ ਨੂੰ 2 ਮਿੰਟ ਬਾਅਦ 94℃ 'ਤੇ ਬਹਾਲ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।
11. Nest-PCR
ਨੇਸਟਡ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਦੇ ਲਗਾਤਾਰ ਦੌਰ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਅਤੇ ਸੰਵੇਦਨਸ਼ੀਲਤਾ ਵਿੱਚ ਸੁਧਾਰ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹਨ।ਪਹਿਲਾ ਦੌਰ 15 ਤੋਂ 20 ਚੱਕਰਾਂ ਦਾ ਇੱਕ ਮਿਆਰੀ ਪ੍ਰਸਾਰ ਹੈ।ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਐਂਪਲੀਫੀਕੇਸ਼ਨ ਉਤਪਾਦ ਦੇ ਇੱਕ ਛੋਟੇ ਹਿੱਸੇ ਨੂੰ 100 ਤੋਂ 1000 ਵਾਰ ਪਤਲਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ 15 ਤੋਂ 20 ਚੱਕਰਾਂ ਲਈ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਦੇ ਦੂਜੇ ਦੌਰ ਵਿੱਚ ਜੋੜਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਵਿਕਲਪਕ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਐਂਪਲੀਫਾਈਡ ਉਤਪਾਦ ਨੂੰ ਜੈੱਲ ਸ਼ੁੱਧੀਕਰਨ ਦੁਆਰਾ ਆਕਾਰ ਦਿੱਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਦੇ ਦੂਜੇ ਦੌਰ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਨੇਸਟਡ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ, ਜੋ ਪਹਿਲੇ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਦੇ ਅੰਦਰ ਟੀਚੇ ਦੇ ਕ੍ਰਮ ਨਾਲ ਜੁੜ ਸਕਦੀ ਹੈ।ਨੇਸਟਡ ਪੀਸੀਆਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਮਲਟੀਪਲ ਟਾਰਗੇਟ ਸਾਈਟਾਂ ਨੂੰ ਵਧਾਉਣ ਦੀ ਸੰਭਾਵਨਾ ਨੂੰ ਘਟਾਉਂਦੀ ਹੈ ਕਿਉਂਕਿ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਦੇ ਦੋਨਾਂ ਸੈੱਟਾਂ ਦੇ ਪੂਰਕ ਕੁਝ ਟੀਚੇ ਦੇ ਕ੍ਰਮ ਹਨ।ਇੱਕੋ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਦੇ ਨਾਲ ਚੱਕਰਾਂ ਦੀ ਇੱਕੋ ਜਿਹੀ ਕੁੱਲ ਗਿਣਤੀ (30 ਤੋਂ 40) ਗੈਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਸਾਈਟਾਂ ਨੂੰ ਵਧਾਉਂਦੀ ਹੈ।ਨੇਸਟਡ ਪੀਸੀਆਰ ਸੀਮਤ ਟੀਚੇ ਦੇ ਕ੍ਰਮਾਂ (ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਦੁਰਲੱਭ ਮਰਨਾ) ਦੀ ਸੰਵੇਦਨਸ਼ੀਲਤਾ ਨੂੰ ਵਧਾਉਂਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਮੁਸ਼ਕਲ PCRS (ਜਿਵੇਂ ਕਿ 5′ RACE) ਦੀ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਨੂੰ ਸੁਧਾਰਦਾ ਹੈ।
12. ਘਟਦੇ ਪੀ.ਸੀ.ਆਰ
ਪੀਸੀਆਰ ਦੇ ਪਹਿਲੇ ਕੁਝ ਚੱਕਰਾਂ ਲਈ ਤੰਗ ਐਨੀਲਿੰਗ ਹਾਲਤਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਡੀਸੀਡਿੰਗ ਪੀਸੀਆਰ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਵਿੱਚ ਸੁਧਾਰ ਕਰਦਾ ਹੈ।ਚੱਕਰ ਅੰਦਾਜ਼ਨ Tm ਤੋਂ ਲਗਭਗ 5℃ ਵੱਧ ਐਨੀਲਿੰਗ ਤਾਪਮਾਨ ਤੋਂ ਸ਼ੁਰੂ ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਫਿਰ ਹਰੇਕ ਚੱਕਰ ਨੂੰ 1℃ ਤੋਂ 2℃ ਤੱਕ ਘਟਾ ਦਿੱਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਜਦੋਂ ਤੱਕ ਐਨੀਲਿੰਗ ਤਾਪਮਾਨ Tm 5℃ ਤੋਂ ਘੱਟ ਨਹੀਂ ਹੁੰਦਾ।ਸਿਰਫ਼ ਉੱਚਤਮ ਸਮਰੂਪਤਾ ਵਾਲਾ ਮੰਜ਼ਿਲ ਟੈਮਪਲੇਟ ਹੀ ਵਧਾਇਆ ਜਾਵੇਗਾ।ਇਹ ਉਤਪਾਦ ਬਾਅਦ ਦੇ ਚੱਕਰਾਂ ਵਿੱਚ ਵਿਸਤਾਰ ਕਰਦੇ ਰਹਿੰਦੇ ਹਨ, ਵਿਸਤ੍ਰਿਤ ਗੈਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਉਤਪਾਦਾਂ ਨੂੰ ਇਕੱਠਾ ਕਰਦੇ ਹਨ।ਡੀਸੀਡਿੰਗ ਪੀਸੀਆਰ ਉਹਨਾਂ ਤਰੀਕਿਆਂ ਲਈ ਲਾਭਦਾਇਕ ਹੈ ਜਿੱਥੇ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਅਤੇ ਟਾਰਗੇਟ ਟੈਂਪਲੇਟ ਵਿਚਕਾਰ ਸਮਰੂਪਤਾ ਦੀ ਡਿਗਰੀ ਨਹੀਂ ਜਾਣੀ ਜਾਂਦੀ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ AFLP DNA ਫਿੰਗਰਪ੍ਰਿੰਟਿੰਗ।
ਸਬੰਧਤ ਪੀਸੀਆਰ ਕਿੱਟਾਂ
2× ਪੀਸੀਆਰ ਹੀਰੋTMਮਿਕਸ ਸਿਸਟਮ ਵਿੱਚ ਆਮ ਪੀਸੀਆਰ ਮਿਕਸ ਸਿਸਟਮ ਨਾਲੋਂ ਪੀਸੀਆਰ ਇਨਿਹਿਬਟਰਾਂ ਲਈ ਉੱਚ ਸਹਿਣਸ਼ੀਲਤਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਇਹ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਗੁੰਝਲਦਾਰ ਟੈਂਪਲੇਟਾਂ ਦੇ ਪੀਸੀਆਰ ਪ੍ਰਸਾਰ ਨਾਲ ਆਸਾਨੀ ਨਾਲ ਸਿੱਝ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਵਿਲੱਖਣ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਪ੍ਰਣਾਲੀ ਅਤੇ ਉੱਚ-ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਵਾਲਾ ਟਾਕ ਹੀਰੋ ਪੀਸੀਆਰ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਨੂੰ ਉੱਚ ਵਿਸਤਾਰ ਕੁਸ਼ਲਤਾ, ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਅਤੇ ਸੰਵੇਦਨਸ਼ੀਲਤਾ ਬਣਾਉਂਦਾ ਹੈ।
ਉੱਚ ਐੰਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਕੁਸ਼ਲਤਾ
ਇਸ ਵਿੱਚ 5'→3' ਡੀਐਨਏ ਪੌਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਗਤੀਵਿਧੀ ਅਤੇ 5'→3' ਐਕਸੋਨੁਕਲੀਜ਼ ਗਤੀਵਿਧੀ ਹੈ, ਬਿਨਾਂ 3'→5' ਐਕਸੋਨੁਕਲੀਜ਼ ਗਤੀਵਿਧੀ।
ਰੀਅਲ ਟਾਈਮ PCR Easyᵀᴹ-SYBR ਗ੍ਰੀਨ I ਕਿੱਟ
ਖਾਸ-ਅਨੁਕੂਲਿਤ ਬਫਰ ਅਤੇ ਹੌਟ-ਸਟਾਰਟ ਟਾਕ ਐਂਜ਼ਾਈਮ ਗੈਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਅਤੇ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਡਾਇਮਰ ਬਣਾਉਣ ਨੂੰ ਰੋਕ ਸਕਦੇ ਹਨ।
ਉੱਚ ਸੰਵੇਦਨਸ਼ੀਲਤਾ - ਟੈਂਪਲੇਟ ਦੀਆਂ ਘੱਟ ਕਾਪੀਆਂ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾ ਸਕਦੀ ਹੈ
ਕਿੱਟ ਇੱਕ ਵਿਲੱਖਣ ਫੋਰਜੀਨ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਰੀਏਜੈਂਟ ਅਤੇ ਫੋਰਜੀਨ ਹੌਟਸਟਾਰ ਟਾਕ ਡੀਐਨਏ ਪੋਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੀ ਹੈ ਜੋ ਇੱਕ ਵਿਲੱਖਣ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਪ੍ਰਣਾਲੀ ਦੇ ਨਾਲ ਮਿਲਾ ਕੇ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਦੀ ਵਿਸਤ੍ਰਿਤ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਅਤੇ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਨੂੰ ਪ੍ਰਭਾਵਸ਼ਾਲੀ ਢੰਗ ਨਾਲ ਸੁਧਾਰਦੀ ਹੈ।
ਪੋਸਟ ਟਾਈਮ: ਮਈ-09-2023
