ਕੋਵਿਡ-19 ਇੱਕ ਛੂਤ ਵਾਲੀ ਬਿਮਾਰੀ ਹੈ ਜੋ ਗੰਭੀਰ ਤੀਬਰ ਸਾਹ ਲੈਣ ਵਾਲੇ ਸਿੰਡਰੋਮ ਕੋਰੋਨਵਾਇਰਸ ਟਾਈਪ 2 ਕਾਰਨ ਹੁੰਦੀ ਹੈ। ਜਦੋਂ ਕੋਈ ਵਿਅਕਤੀ ਸੰਕਰਮਿਤ ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਤਾਂ ਸਭ ਤੋਂ ਆਮ ਲੱਛਣਾਂ ਵਿੱਚ ਬੁਖਾਰ, ਖੰਘ ਅਤੇ ਸਾਹ ਲੈਣ ਵਿੱਚ ਤਕਲੀਫ਼ ਸ਼ਾਮਲ ਹੁੰਦੀ ਹੈ।

ਟੈਸਟਿੰਗ ਲਈ ਵਰਤੇ ਜਾਣ ਵਾਲੇ ਨਮੂਨੇ ਨੈਸੋਫੈਰਨਜੀਲ ਸਵੈਬ ਜਾਂ ਓਰੋਫੈਰਨਜੀਲ ਸਵੈਬ ਦੁਆਰਾ ਇਕੱਠੇ ਕੀਤੇ ਜਾ ਸਕਦੇ ਹਨ।

ਪੀਸੀਆਰ ਕੀ ਹੈ?

ਕੋਰੋਨਵਾਇਰਸ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾਉਣ ਦਾ ਮਿਆਰੀ ਤਰੀਕਾ ਪੋਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਚੇਨ ਰਿਐਕਸ਼ਨ, ਪੀ.ਸੀ.ਆਰ.ਇਹ ਇੱਕ ਵਿਧੀ ਹੈ ਜੋ ਅਣੂ ਜੀਵ ਵਿਗਿਆਨ ਵਿੱਚ ਵਿਆਪਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਵਰਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ।ਇਹ ਲੱਖਾਂ ਤੋਂ ਅਰਬਾਂ ਖਾਸ ਡੀਐਨਏ ਟੁਕੜਿਆਂ ਦੀ ਤੇਜ਼ੀ ਨਾਲ ਨਕਲ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ।

ਨਵੇਂ ਕੋਰੋਨਾਵਾਇਰਸ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਬਹੁਤ ਹੀ ਲੰਬਾ ਸਿੰਗਲ-ਸਟੈਂਡਡ RNA ਜੀਨੋਮ ਹੁੰਦਾ ਹੈ।ਪੀਸੀਆਰ ਦੁਆਰਾ ਇਹਨਾਂ ਵਾਇਰਸਾਂ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾਉਣ ਲਈ, ਆਰਐਨਏ ਅਣੂਆਂ ਨੂੰ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟੇਜ ਦੁਆਰਾ ਉਹਨਾਂ ਦੇ ਪੂਰਕ ਡੀਐਨਏ ਕ੍ਰਮ ਵਿੱਚ ਬਦਲਿਆ ਜਾਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਫਿਰ ਨਵੇਂ ਸੰਸ਼ਲੇਸ਼ਿਤ ਡੀਐਨਏ ਨੂੰ ਮਿਆਰੀ ਪੀਸੀਆਰ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆਵਾਂ ਦੁਆਰਾ ਵਧਾਇਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਜਿਸਨੂੰ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਆਰਟੀ-ਪੀਸੀਆਰ ਕਿਹਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।

RT-PCR ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ

ਆਰਐਨਏ ਕੱਢਣ

ਇਸ ਵਿਧੀ ਨੂੰ ਕਰਨ ਲਈ, ਵਾਇਰਲ ਆਰਐਨਏ ਨੂੰ ਮੂਲ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਕੱਢਿਆ ਜਾਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ.ਸੁਵਿਧਾਜਨਕ, ਤੇਜ਼ ਅਤੇ ਪ੍ਰਭਾਵੀ ਵਿਭਾਜਨ ਲਈ ਕਈ ਤਰ੍ਹਾਂ ਦੀਆਂ RNA ਸ਼ੁੱਧੀਕਰਨ ਕਿੱਟਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਜਾ ਸਕਦੀ ਹੈ।

ਇੱਕ ਵਪਾਰਕ ਕਿੱਟ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਵਾਇਰਲ RNA ਨੂੰ ਕੱਢਣ ਲਈ, ਪਹਿਲਾਂ ਨਮੂਨੇ ਨੂੰ ਇੱਕ ਮਾਈਕ੍ਰੋਸੈਂਟਰੀਫਿਊਜ ਟਿਊਬ ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ ਕਰੋ ਅਤੇ ਫਿਰ ਇਸਨੂੰ ਲਾਈਸਿਸ ਬਫਰ ਨਾਲ ਮਿਲਾਓ।ਇਹ ਬਫਰ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਵਿਗੜਿਆ ਹੋਇਆ ਹੈ ਅਤੇ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਫਿਨੋਲ ਅਤੇ ਗੁਆਨੀਡੀਨ ਆਈਸੋਥਿਓਸਾਈਨੇਟ ਦੇ ਹੁੰਦੇ ਹਨ।ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, RNase ਇਨਿਹਿਬਟਰਜ਼ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਲਾਈਸਿਸ ਬਫਰ ਵਿੱਚ ਮੌਜੂਦ ਹੁੰਦੇ ਹਨ ਤਾਂ ਜੋ ਬਰਕਰਾਰ ਵਾਇਰਲ ਆਰਐਨਏ ਦੀ ਅਲੱਗਤਾ ਨੂੰ ਯਕੀਨੀ ਬਣਾਇਆ ਜਾ ਸਕੇ।

ਲਾਈਸਿਸ ਬਫਰ ਨੂੰ ਜੋੜਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਨਬਜ਼ ਦੁਆਰਾ ਮਿਕਸਿੰਗ ਟਿਊਬ ਨੂੰ ਘੁੰਮਾਓ ਅਤੇ ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕਰੋ।ਵਾਇਰਸ ਨੂੰ ਫਿਰ ਲਾਈਸਿਸ ਬਫਰ ਦੁਆਰਾ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕੀਤੀਆਂ ਗਈਆਂ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਵਿਨਾਸ਼ਕਾਰੀ ਸਥਿਤੀਆਂ ਅਧੀਨ ਲਾਈਜ਼ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।

ਨਮੂਨੇ ਨੂੰ ਲਾਈਜ਼ ਕੀਤੇ ਜਾਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਸ਼ੁੱਧੀਕਰਨ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਲਈ ਇੱਕ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਜ ਟਿਊਬ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ।ਨਮੂਨੇ ਨੂੰ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਜ ਟਿਊਬ ਵਿੱਚ ਲੋਡ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਫਿਰ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਜ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।

ਇਹ ਵਿਧੀ ਇੱਕ ਠੋਸ ਪੜਾਅ ਕੱਢਣ ਦੀ ਵਿਧੀ ਹੈ ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਸਥਿਰ ਪੜਾਅ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਸਿਲਿਕਾ ਜੈੱਲ ਮੈਟ੍ਰਿਕਸ ਹੁੰਦਾ ਹੈ।

ਅਨੁਕੂਲ ਲੂਣ ਅਤੇ pH ਸਥਿਤੀਆਂ ਦੇ ਤਹਿਤ, RNA ਅਣੂ ਸਿਲਿਕਾ ਝਿੱਲੀ ਨਾਲ ਜੁੜ ਜਾਂਦੇ ਹਨ।

ਉਸੇ ਸਮੇਂ, ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਅਤੇ ਹੋਰ ਗੰਦਗੀ ਨੂੰ ਹਟਾ ਦਿੱਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ.

ਸੈਂਟਰੀਫਿਊਗੇਸ਼ਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਜ ਟਿਊਬ ਨੂੰ ਇੱਕ ਸਾਫ਼ ਕਲੈਕਸ਼ਨ ਟਿਊਬ ਵਿੱਚ ਪਾਓ, ਫਿਲਟਰੇਟ ਨੂੰ ਰੱਦ ਕਰੋ, ਅਤੇ ਫਿਰ ਵਾਸ਼ਿੰਗ ਬਫਰ ਸ਼ਾਮਲ ਕਰੋ।

ਝਿੱਲੀ ਦੁਆਰਾ ਧੋਣ ਵਾਲੇ ਬਫਰ ਨੂੰ ਮਜਬੂਰ ਕਰਨ ਲਈ ਟਿਊਬ ਨੂੰ ਦੁਬਾਰਾ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਜ ਵਿੱਚ ਰੱਖੋ।ਇਹ ਝਿੱਲੀ ਤੋਂ ਬਾਕੀ ਬਚੀਆਂ ਸਾਰੀਆਂ ਅਸ਼ੁੱਧੀਆਂ ਨੂੰ ਹਟਾ ਦੇਵੇਗਾ, ਸਿਰਫ਼ RNA ਨੂੰ ਸਿਲਿਕਾ ਜੈੱਲ ਨਾਲ ਬੰਨ੍ਹ ਕੇ ਛੱਡ ਦੇਵੇਗਾ।

ਨਮੂਨਾ ਧੋਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਟਿਊਬ ਨੂੰ ਇੱਕ ਸਾਫ਼ ਮਾਈਕ੍ਰੋਸੈਂਟਰੀਫਿਊਜ ਟਿਊਬ ਵਿੱਚ ਪਾਓ ਅਤੇ ਇਲਿਊਸ਼ਨ ਬਫਰ ਸ਼ਾਮਲ ਕਰੋ।

ਫਿਰ ਇਸ ਨੂੰ ਝਿੱਲੀ ਰਾਹੀਂ ਇਲੂਸ਼ਨ ਬਫਰ ਨੂੰ ਮਜਬੂਰ ਕਰਨ ਲਈ ਕੇਂਦਰਿਤ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਇਲਿਊਸ਼ਨ ਬਫਰ ਸਪਿੱਨ ਕਾਲਮ ਤੋਂ ਵਾਇਰਲ RNA ਨੂੰ ਹਟਾ ਦਿੰਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ, ਇਨਿਹਿਬਟਰਸ ਅਤੇ ਹੋਰ ਗੰਦਗੀ ਤੋਂ ਮੁਕਤ RNA ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਦਾ ਹੈ।

ਕਦਮ 2

ਮਿਸ਼ਰਤ ਧਿਆਨ

ਵਾਇਰਲ ਆਰਐਨਏ ਨੂੰ ਐਕਸਟਰੈਕਟ ਕਰਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਅਗਲਾ ਕਦਮ ਪੀਸੀਆਰ ਪ੍ਰਸਾਰਣ ਲਈ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਮਿਸ਼ਰਣ ਤਿਆਰ ਕਰਨਾ ਹੈ।ਇਸ ਪੜਾਅ ਵਿੱਚ, ਧਿਆਨ ਕੇਂਦਰਿਤ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ.ਇਹ ਕੇਂਦਰਿਤ ਘੋਲ ਪ੍ਰੀਮਿਕਸ, ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟਸ, ਨਿਊਕਲੀਓਟਾਈਡਸ, ਫਾਰਵਰਡ ਪ੍ਰਾਈਮਰ, ਰਿਵਰਸ ਪ੍ਰਾਈਮਰ, ਟਾਕਮੈਨ ਪ੍ਰੋਬ ਅਤੇ ਡੀਐਨਏ ਪੋਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਵਾਲਾ ਇੱਕ ਪ੍ਰੀਮਿਕਸਡ ਕੇਂਦਰਿਤ ਹੱਲ ਹੈ।

ਅੰਤ ਵਿੱਚ, ਇਸ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਮਿਸ਼ਰਣ ਨੂੰ ਪੂਰਾ ਕਰਨ ਲਈ, RNA ਟੈਂਪਲੇਟ ਜੋੜਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਟਿਊਬਾਂ ਨੂੰ ਪਲਸ ਵੋਰਟੈਕਸਿੰਗ ਦੁਆਰਾ ਮਿਲਾਇਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਫਿਰ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਮਿਸ਼ਰਣ ਨੂੰ ਪੀਸੀਆਰ ਪਲੇਟ ਵਿੱਚ ਲੋਡ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਪੀਸੀਆਰ ਪਲੇਟ ਵਿੱਚ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ 96 ਖੂਹ ਹੁੰਦੇ ਹਨ ਅਤੇ ਇੱਕੋ ਸਮੇਂ ਕਈ ਨਮੂਨਿਆਂ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹਨ।

ਕਦਮ 3

ਪੀਸੀਆਰ ਪ੍ਰਸਾਰਣ

ਅੱਗੇ, ਪਲੇਟ ਨੂੰ ਪੀਸੀਆਰ ਮਸ਼ੀਨ ਵਿੱਚ ਰੱਖੋ, ਜੋ ਕਿ ਜ਼ਰੂਰੀ ਤੌਰ 'ਤੇ ਥਰਮਲ ਸਾਈਕਲਰ ਹੈ।

ਰੀਅਲ-ਟਾਈਮ RT-PCR ਦੀ ਵਰਤੋਂ RdrRP ਜੀਨ, E ਜੀਨ ਅਤੇ N ਜੀਨ ਵਿੱਚ ਟੀਚੇ ਦੇ ਕ੍ਰਮ ਨੂੰ ਵਧਾ ਕੇ 2019 ਦੇ ਨਾਵਲ ਕੋਰੋਨਾਵਾਇਰਸ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾਉਣ ਲਈ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ।ਟੀਚੇ ਦੇ ਜੀਨ ਦੀ ਚੋਣ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਅਤੇ ਜਾਂਚ ਕ੍ਰਮ 'ਤੇ ਨਿਰਭਰ ਕਰਦੀ ਹੈ।

RT-PCR ਦਾ ਪਹਿਲਾ ਕਦਮ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਹੈ।ਪੂਰਕ ਡੀਐਨਏ ਦਾ ਪਹਿਲਾ ਸਟ੍ਰੈਂਡ ਸਿੰਥੇਸਾਈਜ਼ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਜੋ ਪੀਸੀਆਰ ਰਿਵਰਸ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਦੁਆਰਾ ਸ਼ੁਰੂ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਜੋ ਵਾਇਰਲ ਆਰਐਨਏ ਜੀਨੋਮ ਦੇ ਪੂਰਕ ਹਿੱਸੇ ਨਾਲ ਜੁੜਦਾ ਹੈ।ਫਿਰ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟਸ ਵਾਇਰਲ ਆਰਐਨਏ ਦੇ ਪੂਰਕ ਡੀਐਨਏ ਨੂੰ ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਕਰਨ ਲਈ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਦੇ 3′ਸਿਰੇ ਵਿੱਚ ਡੀਐਨਏ ਨਿਊਕਲੀਓਟਾਈਡ ਜੋੜਦਾ ਹੈ।ਇਸ ਪਗ ਦਾ ਤਾਪਮਾਨ ਅਤੇ ਮਿਆਦ ਪ੍ਰਾਈਮਰ, ਟਾਰਗੇਟ ਆਰਐਨਏ, ਅਤੇ ਵਰਤੇ ਗਏ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟੇਜ 'ਤੇ ਨਿਰਭਰ ਕਰਦੀ ਹੈ।

ਅੱਗੇ, ਇੱਕ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਵਿਨਾਸ਼ਕਾਰੀ ਪੜਾਅ ਲਾਗੂ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਜਿਸਦੇ ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਆਰਐਨਏ-ਡੀਐਨਏ ਹਾਈਬ੍ਰਿਡ ਦੀ ਵਿਨਾਸ਼ਕਾਰੀ ਹੁੰਦੀ ਹੈ।ਇਹ ਕਦਮ ਡੀਐਨਏ ਪੌਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਨੂੰ ਸਰਗਰਮ ਕਰਨ ਲਈ ਜ਼ਰੂਰੀ ਹੈ।ਉਸੇ ਸਮੇਂ, ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟਸ ਨੂੰ ਅਕਿਰਿਆਸ਼ੀਲ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ.

ਪੀਸੀਆਰ ਵਿੱਚ ਥਰਮਲ ਚੱਕਰਾਂ ਦੀ ਇੱਕ ਲੜੀ ਹੁੰਦੀ ਹੈ।ਹਰੇਕ ਚੱਕਰ ਵਿੱਚ ਵਿਨਾਸ਼ਕਾਰੀ, ਐਨੀਲਿੰਗ ਅਤੇ ਐਕਸਟੈਂਸ਼ਨ ਪੜਾਅ ਸ਼ਾਮਲ ਹੁੰਦੇ ਹਨ।

ਡੀਨੈਚੁਰੇਸ਼ਨ ਸਟੈਪ ਵਿੱਚ ਰਿਐਕਸ਼ਨ ਚੈਂਬਰ ਨੂੰ 95 ਡਿਗਰੀ ਸੈਲਸੀਅਸ ਤੱਕ ਗਰਮ ਕਰਨਾ ਅਤੇ ਡਬਲ-ਸਟ੍ਰੈਂਡਡ ਡੀਐਨਏ ਟੈਂਪਲੇਟ ਦੇ ਵਿਨਾਸ਼ਕਾਰੀ ਲਈ ਇਸਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਨਾ ਸ਼ਾਮਲ ਹੈ।

ਅਗਲੇ ਪੜਾਅ ਵਿੱਚ, ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਦਾ ਤਾਪਮਾਨ 58 ਡਿਗਰੀ ਸੈਲਸੀਅਸ ਤੱਕ ਘਟਾ ਦਿੱਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਜਿਸ ਨਾਲ ਫਾਰਵਰਡ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਨੂੰ ਇਸਦੇ ਸਿੰਗਲ-ਸਟ੍ਰੈਂਡਡ ਡੀਐਨਏ ਟੈਂਪਲੇਟ ਦੇ ਪੂਰਕ ਹਿੱਸੇ ਨਾਲ ਜੋੜਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਐਨੀਲਿੰਗ ਦਾ ਤਾਪਮਾਨ ਸਿੱਧਾ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਦੀ ਲੰਬਾਈ ਅਤੇ ਰਚਨਾ 'ਤੇ ਨਿਰਭਰ ਕਰਦਾ ਹੈ।

ਐਕਸਟੈਂਸ਼ਨ ਸਟੈਪ ਵਿੱਚ, ਡੀਐਨਏ ਪੋਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਇੱਕ ਨਵੇਂ ਡੀਐਨਏ ਸਟ੍ਰੈਂਡ ਦਾ ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਕਰਦਾ ਹੈ ਜੋ ਡੀਐਨਏ ਟੈਂਪਲੇਟ ਸਟ੍ਰੈਂਡ ਦੇ ਪੂਰਕ ਹੈ।ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਮਿਸ਼ਰਣ ਤੋਂ 5′ਤੋਂ 3′ਦਿਸ਼ਾ ਵਿੱਚ ਟੈਪਲੇਟ ਵਿੱਚ ਮੁਫਤ ਨਿਊਕਲੀਅਸ ਪੂਰਕ ਜੋੜ ਕੇ।ਇਸ ਪੜਾਅ ਦਾ ਤਾਪਮਾਨ ਵਰਤੇ ਗਏ ਡੀਐਨਏ ਪੋਲੀਮੇਰੇਜ਼ 'ਤੇ ਨਿਰਭਰ ਕਰਦਾ ਹੈ।

ਪਹਿਲੇ ਚੱਕਰ ਦੇ ਬਾਅਦ, ਇੱਕ ਡਬਲ-ਸਟ੍ਰੈਂਡਡ ਡੀਐਨਏ ਟੀਚਾ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ.

ਫਿਰ, ਦੂਜਾ ਚੱਕਰ ਦਿਓ.ਡਬਲ-ਸਟ੍ਰੈਂਡਡ ਡੀਐਨਏ ਨੂੰ ਦੋ ਸਿੰਗਲ-ਸਟ੍ਰੈਂਡਡ ਡੀਐਨਏ ਅਣੂ ਪੈਦਾ ਕਰਨ ਲਈ ਵਿਅਕਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ।

ਅਗਲੇ ਪੜਾਅ ਵਿੱਚ, ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਦਾ ਤਾਪਮਾਨ ਘਟਾਇਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਨੂੰ ਹਰੇਕ ਸਿੰਗਲ-ਸਟ੍ਰੈਂਡਡ ਡੀਐਨਏ ਟੈਂਪਲੇਟ ਨਾਲ ਜੋੜਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਟਾਕ-ਮੈਨ ਪੜਤਾਲ ਨੂੰ ਟੀਚੇ ਦੇ ਡੀਐਨਏ ਦੇ ਪੂਰਕ ਹਿੱਸੇ ਨਾਲ ਜੋੜਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।

TaqMan ਪੜਤਾਲ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਫਲੋਰੋਫੋਰਰ ਹੁੰਦਾ ਹੈ ਜੋ ਓਲੀਗੋਨਿਊਕਲੀਓਟਾਈਡ ਜਾਂਚ ਦੇ 5′ਸਿਰੇ ਨਾਲ ਜੁੜਿਆ ਹੁੰਦਾ ਹੈ।ਜਦੋਂ ਸਾਈਕਲਰ ਦੇ ਰੋਸ਼ਨੀ ਸਰੋਤ ਦੁਆਰਾ ਉਤਸ਼ਾਹਿਤ ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਤਾਂ ਫਲੋਰੋਫੋਰਸ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਛੱਡਦਾ ਹੈ।ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਪੜਤਾਲ 3′ਐਂਡ 'ਤੇ ਇੱਕ ਕਵੇਂਚਰ ਨਾਲ ਬਣੀ ਹੋਈ ਹੈ।ਰਿਪੋਟਰ ਜੀਨ ਦੀ ਨੇੜਤਾ ਬੁਝਾਉਣ ਵਾਲੇ ਦੇ ਨਾਲ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਦੀ ਖੋਜ ਨੂੰ ਰੋਕਦੀ ਹੈ.

ਐਕਸਟੈਂਸ਼ਨ ਪੜਾਅ ਵਿੱਚ, ਡੀਐਨਏ ਪੌਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਇੱਕ ਨਵੇਂ ਸਟ੍ਰੈਂਡ ਦਾ ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਕਰਦਾ ਹੈ।ਜਦੋਂ ਪੌਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਟਾਕਮੈਨ ਪ੍ਰੋਬ ਤੱਕ ਪਹੁੰਚਦਾ ਹੈ, ਤਾਂ ਇਸਦੀ ਐਂਡੋਜੇਨਸ 5′ਨਿਊਕਲੀਜ਼ ਗਤੀਵਿਧੀ ਜਾਂਚ ਨੂੰ ਕਲੀਵ ਕਰ ਦਿੰਦੀ ਹੈ, ਡਾਈ ਨੂੰ ਕਵੇਂਚਰ ਤੋਂ ਵੱਖ ਕਰਦੀ ਹੈ।

ਪੀਸੀਆਰ ਦੇ ਹਰੇਕ ਚੱਕਰ ਦੇ ਨਾਲ, ਵਧੇਰੇ ਰੰਗ ਦੇ ਅਣੂ ਜਾਰੀ ਕੀਤੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ, ਜਿਸਦੇ ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਸੰਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤੇ ਗਏ ਐਂਪਲੀਕਨਾਂ ਦੀ ਸੰਖਿਆ ਦੇ ਅਨੁਪਾਤ ਵਿੱਚ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਤੀਬਰਤਾ ਵਿੱਚ ਵਾਧਾ ਹੁੰਦਾ ਹੈ।

ਇਹ ਵਿਧੀ ਨਮੂਨੇ ਵਿੱਚ ਮੌਜੂਦ ਇੱਕ ਦਿੱਤੇ ਕ੍ਰਮ ਦੀ ਸੰਖਿਆ ਦਾ ਅੰਦਾਜ਼ਾ ਲਗਾਉਣ ਦੀ ਆਗਿਆ ਦਿੰਦੀ ਹੈ।ਡਬਲ-ਸਟੈਂਡਡ ਡੀਐਨਏ ਦੇ ਟੁਕੜਿਆਂ ਦੀ ਗਿਣਤੀ ਹਰੇਕ ਚੱਕਰ ਵਿੱਚ ਦੁੱਗਣੀ ਹੋ ਜਾਂਦੀ ਹੈ।ਇਸ ਲਈ, ਪੀਸੀਆਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਬਹੁਤ ਛੋਟੇ ਨਮੂਨਿਆਂ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕਰਨ ਲਈ ਕੀਤੀ ਜਾ ਸਕਦੀ ਹੈ।

ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਸਿਗਨਲ, ਟੰਗਸਟਨ ਹੈਲੋਜਨ ਲੈਂਪ, ਐਕਸਾਈਟੇਸ਼ਨ ਫਿਲਟਰ, ਰਿਫਲੈਕਟਰ, ਲੈਂਸ, ਐਮਿਸ਼ਨ ਫਿਲਟਰ ਅਤੇ ਚਾਰਜ ਕਪਲਡ ਡਿਵਾਈਸ-ਯੂਜ਼ CCD ਕੈਮਰਾ ਮਾਪਣ ਲਈ।

ਕਦਮ 4 ਪਤਾ ਲਗਾਓ

ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਸਿਗਨਲ, ਟੰਗਸਟਨ ਹੈਲੋਜਨ ਲੈਂਪ, ਐਕਸਾਈਟੇਸ਼ਨ ਫਿਲਟਰ, ਰਿਫਲੈਕਟਰ, ਲੈਂਸ, ਐਮਿਸ਼ਨ ਫਿਲਟਰ ਅਤੇ ਚਾਰਜ ਕਪਲਡ ਡਿਵਾਈਸ-ਯੂਜ਼ CCD ਕੈਮਰਾ ਮਾਪਣ ਲਈ।

ਲੈਂਪ ਤੋਂ ਫਿਲਟਰ ਕੀਤੀ ਰੋਸ਼ਨੀ ਰਿਫਲੈਕਟਰ ਦੁਆਰਾ ਪ੍ਰਤੀਬਿੰਬਿਤ ਹੁੰਦੀ ਹੈ, ਕੰਡੈਂਸਰ ਲੈਂਸ ਵਿੱਚੋਂ ਲੰਘਦੀ ਹੈ, ਅਤੇ ਹਰੇਕ ਮੋਰੀ ਦੇ ਕੇਂਦਰ ਵਿੱਚ ਕੇਂਦਰਿਤ ਹੁੰਦੀ ਹੈ।ਫਿਰ ਮੋਰੀ ਤੋਂ ਨਿਕਲਿਆ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਸ਼ੀਸ਼ੇ ਤੋਂ ਪ੍ਰਤੀਬਿੰਬਤ ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਐਮਿਸ਼ਨ ਫਿਲਟਰ ਵਿੱਚੋਂ ਲੰਘਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ CCD ਕੈਮਰੇ ਦੁਆਰਾ ਖੋਜਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਹਰੇਕ ਪੀਸੀਆਰ ਚੱਕਰ ਵਿੱਚ, ਸੀਸੀਡੀ ਦੁਆਰਾ ਸਵੈ-ਉਤਸ਼ਾਹਿਤ ਫਲੋਰੋਫੋਰ ਲਾਈਟ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾਇਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।

ਇਹ ਕੈਪਚਰ ਕੀਤੀ ਰੋਸ਼ਨੀ ਨੂੰ ਡਿਜੀਟਲ ਡੇਟਾ ਵਿੱਚ ਬਦਲਦਾ ਹੈ।ਇਸ ਵਿਧੀ ਨੂੰ ਰੀਅਲ-ਟਾਈਮ ਪੀਸੀਆਰ ਕਿਹਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਇਹ ਪੀਸੀਆਰ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਦੀ ਪ੍ਰਗਤੀ ਦੀ ਅਸਲ-ਸਮੇਂ ਦੀ ਨਿਗਰਾਨੀ ਦੀ ਆਗਿਆ ਦਿੰਦਾ ਹੈ।