ਹਰ ਕੋਈ qRT-PCR ਪ੍ਰਯੋਗ ਦੇ ਸਿਧਾਂਤ, ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਡਿਜ਼ਾਈਨ, ਨਤੀਜੇ ਦੀ ਵਿਆਖਿਆ, ਆਦਿ ਬਾਰੇ ਗੱਲ ਕਰ ਰਿਹਾ ਹੈ, ਪਰ ਮੈਨੂੰ ਲਗਦਾ ਹੈ ਕਿ ਮੈਨੂੰ ਤੁਹਾਡੇ ਨਾਲ qRT-PCR ਦੇ ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਸੰਚਾਲਨ ਨੂੰ ਸਾਂਝਾ ਕਰਨਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ।ਇਹ ਛੋਟਾ ਹੈ, ਪਰ ਇਹ ਨਤੀਜਿਆਂ ਬਾਰੇ ਹੈ।
qRT-PCR ਕਰਨ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ, ਸਾਨੂੰ ਆਪਣੇ RNA ਅਤੇ ਆਪਰੇਸ਼ਨ ਦੇ ਤਰੀਕਿਆਂ ਦੀ ਸਪਸ਼ਟ ਸਮਝ ਹੋਣੀ ਚਾਹੀਦੀ ਹੈ।ਆਖ਼ਰਕਾਰ, ਸਾਡੇ ਯਤਨਾਂ ਦਾ ਉਦੇਸ਼ ਸਿਰਫ਼ ਅਭਿਆਸ ਕਰਨ ਦੀ ਬਜਾਏ ਨਤੀਜੇ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਨਾ ਹੈ।ਇਸ ਲਈ qRT-PCR ਕਰਨ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ, ਸਾਨੂੰ ਹੇਠਾਂ ਦਿੱਤੇ ਮੁੱਦਿਆਂ ਨੂੰ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨ ਦੀ ਲੋੜ ਹੈ (ਜਿਨ੍ਹਾਂ ਵਿੱਚੋਂ ਕੁਝ ਸਿਰਫ਼ SYBR 'ਤੇ ਲਾਗੂ ਹਨ)।
1 ਕੀ ਤੁਹਾਨੂੰ ਯਕੀਨ ਹੈ ਕਿ ਤੁਹਾਡਾ ਆਰ ਐਨ ਏ ਡੀਗਰੇਡ ਨਹੀਂ ਹੋਇਆ ਹੈ?
NanoDrop 2000 ਸਿਰਫ਼ RNA ਦੀ ਇਕਾਗਰਤਾ ਅਤੇ ਸ਼ੁੱਧਤਾ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਪਰ RNA ਦੀ ਇਕਸਾਰਤਾ ਦਾ ਪਤਾ ਨਹੀਂ ਲਗਾ ਸਕਦਾ।
RNA (RNA Intesity Number) ਮੁੱਲ RNA ਦੀ ਇਕਸਾਰਤਾ ਨੂੰ ਦਰਸਾ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ Agilent 2100 Bioanalyzer ਸਿਸਟਮ ਦੁਆਰਾ ਖੋਜਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।
ਚਿੱਤਰ. ਵੱਖ-ਵੱਖ RNA ਨਮੂਨਿਆਂ (ਯੂਕੇਰੀਓਟਸ) ਲਈ RIN ਮੁੱਲਾਂ ਦਾ ਯੋਜਨਾਬੱਧ ਚਿੱਤਰ
ਹਾਲਾਂਕਿ, ਪ੍ਰਯੋਗਸ਼ਾਲਾਵਾਂ ਵਿੱਚ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ Agilent 2100 Bioanalyzer ਨਹੀਂ ਹੁੰਦਾ ਹੈ।ਇਸ ਸਥਿਤੀ ਵਿੱਚ, ਅਸੀਂ ਫਾਰਮਾਲਡੀਹਾਈਡ ਜੈੱਲ ਦੁਆਰਾ ਖੋਜ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹਾਂ, ਪਰ ਆਰਐਨਏ ਦੀ ਕੁੱਲ ਮਾਤਰਾ ਲਈ ਲੋੜ ਜ਼ਿਆਦਾ ਹੈ, ਇਸ ਲਈ ਸਭ ਤੋਂ ਤੇਜ਼ ਤਰੀਕਾ ਹੈ ਆਮ ਜੈੱਲ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਫੋਰੇਸਿਸ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਨਾ।ਇਹ ਨਿਊਕਲੀਜ਼-ਮੁਕਤ ਵਾਤਾਵਰਣ ਵਿੱਚ ਹੋਣਾ ਜ਼ਰੂਰੀ ਹੈ, ਇਸ ਲਈ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਫੋਰਸਿਸ ਟੈਂਕ, ਸੋਲ ਬੋਤਲ, ਜੈੱਲ ਬਰੈਕਟ ਅਤੇ DEPC ਪਾਣੀ ਨਾਲ ਕੰਘੀ ਨੂੰ ਕੁਰਲੀ ਕਰਨਾ ਜ਼ਰੂਰੀ ਹੈ।ਐਗਰੋਜ਼ ਵੀ ਨਿਊਕਲੀਜ਼-ਮੁਕਤ ਹੁੰਦਾ ਹੈ (ਜਿੰਨਾ ਚਿਰ ਇਹ ਤਾਜ਼ੇ ਖੋਲ੍ਹਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ), ਅਤੇ ਲੋਡਿੰਗ ਬਫਰ ਨੂੰ 1.2% ਜੈੱਲ ਦੇ ਨਾਲ ਜਿੰਨਾ ਸੰਭਵ ਹੋ ਸਕੇ ਤਾਜ਼ੇ ਤੌਰ 'ਤੇ ਖੋਲ੍ਹਿਆ ਜਾਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ।
ਨੋਟ ਕਰੋ ਕਿ ਜੈੱਲ ਨੂੰ ਪੂਰੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਭੰਗ ਕੀਤਾ ਜਾਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ, ਨਹੀਂ ਤਾਂ ਇਹ ਅਸੰਗਤ ਬੈਂਡਾਂ ਦਾ ਕਾਰਨ ਬਣੇਗਾ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਚਿੱਤਰ ਵਿੱਚ ਨਮੂਨਾ 9 ਵਿੱਚ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ।ਜੇਕਰ ਵੋਲਟੇਜ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਹੈ ਜਾਂ ਬਹੁਤ ਦੇਰ ਤੱਕ ਚੱਲਦੀ ਹੈ ਤਾਂ ਗਰਮੀ ਪੈਦਾ ਹੋਵੇਗੀ ਅਤੇ ਆਰਐਨਏ ਡਿਗਰੇਡੇਸ਼ਨ ਦਾ ਕਾਰਨ ਬਣੇਗੀ, ਇਸ ਲਈ ਵੋਲਟੇਜ ਅਤੇ ਸਮੇਂ ਨੂੰ ਉਚਿਤ ਢੰਗ ਨਾਲ ਕੰਟਰੋਲ ਕੀਤਾ ਜਾਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ।ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਜੈੱਲ ਚਲਾਉਣਾ ਇਹ ਵੀ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ ਕਿ ਕੀ ਨਮੂਨੇ ਵਿੱਚ ਡੀਐਨਏ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਹੈ, ਅਤੇ ਇਹ ਨਿਰੀਖਣ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ ਕਿ ਕੀ ਡਿਸਪੈਂਸਿੰਗ ਖੂਹ ਵਿੱਚ ਵੱਡੀ ਗਿਣਤੀ ਵਿੱਚ ਬਰਕਰਾਰ ਬੈਂਡ ਹਨ।
ਚਿੱਤਰ.ਆਰਐਨਏ ਦੀ ਜੈੱਲ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਫੋਰੇਸਿਸ ਖੋਜ
2 ਕੀ ਤੁਸੀਂ ਆਪਣੇ cDNA ਦੀ ਇਕਾਗਰਤਾ ਬਾਰੇ ਯਕੀਨੀ ਹੋ?
ਪ੍ਰਯੋਗਸ਼ਾਲਾ ਵਿੱਚ ਵੱਡੇ ਭਰਾਵਾਂ ਦਾ ਤਜਰਬਾ ਇਹ ਹੈ ਕਿ ਹਰੇਕ ਉਲਟ ਦੁਆਰਾ ਪ੍ਰਾਪਤ 20 ul ਪ੍ਰਣਾਲੀ ਦੇ ਸੀਡੀਐਨਏ ਨੂੰ ਸਿੱਧੇ ਤੌਰ 'ਤੇ 20X ਪਤਲਾ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਜਦੋਂ ਕਿ ਪੋਸਟ-ਡਾਕਟੋਰਲ ਭੈਣਾਂ ਨੂੰ 10X ਪਤਲਾ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਮੈਂ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਸਥਿਤੀ 'ਤੇ ਨਿਰਭਰ ਕਰਦਾ ਹਾਂ।ਕਿਉਂਕਿ ਹਰੇਕ ਵਿਅਕਤੀ ਦੁਆਰਾ ਦਰਸਾਏ ਗਏ ਆਰਐਨਏ ਦੀ ਗੁਣਵੱਤਾ ਵੱਖਰੀ ਹੁੰਦੀ ਹੈ, ਰਿਵਰਸਲ ਦਾ ਪੱਧਰ ਵੀ ਵੱਖਰਾ ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਰਿਵਰਸਲ ਤਕਨਾਲੋਜੀ ਸਥਿਰ ਨਹੀਂ ਹੋ ਸਕਦੀ।
ਇਸ ਲਈ ਹਰ ਵਾਰ ਜਦੋਂ ਮੈਨੂੰ ਉਲਟਾ ਸੀਡੀਐਨਏ ਮਿਲਦਾ ਹੈ, ਮੈਂ ਪਹਿਲਾਂ ਇਸਨੂੰ ਲਗਭਗ 3 ਵਾਰ ਪਤਲਾ ਕਰਾਂਗਾ, ਅਤੇ ਫਿਰ RT-PCR ਕਰਨ ਲਈ ਹਾਊਸਕੀਪਿੰਗ ਜੀਨ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਾਂਗਾ, ਖਾਸ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕਰਨ ਲਈ, ਚੱਕਰਾਂ ਦੀ ਗਿਣਤੀ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ 25 ਚੱਕਰ ਹੁੰਦੀ ਹੈ, ਅਤੇ ਫਿਰ ਅੰਤਮ ਪਤਲਾ ਕਾਰਕ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਾਂਗਾ।
3 ਕੀ ਤੁਹਾਨੂੰ ਯਕੀਨ ਹੈ ਕਿ ਤੁਹਾਡੇ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਵਰਤਣ ਵਿੱਚ ਆਸਾਨ ਹਨ?
ਇਹ qRT-PCR ਦੇ ਪਿਘਲਣ ਵਾਲੇ ਵਕਰ ਨੂੰ ਪਾਸ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਪਰ ਇਸ ਲਈ ਅਜੇ ਵੀ ਪੈਸਾ ਖਰਚ ਹੁੰਦਾ ਹੈ।ਬਹੁਤ ਸਾਰੇ ਪੈਸੇ ਤੋਂ ਬਿਨਾਂ ਪ੍ਰਯੋਗਸ਼ਾਲਾਵਾਂ ਲਈ, ਜਦੋਂ ਉਹਨਾਂ ਨੂੰ ਬਹੁਤ ਸਾਰੇ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਮਿਲਦੇ ਹਨ, ਤਾਂ ਉਹ ਇਹ ਦੇਖਣ ਲਈ ਕਿ ਕੀ ਇਹ ਇੱਕ ਸਿੰਗਲ ਬੈਂਡ ਹੈ ਅਤੇ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਦੀ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕਰਨ ਲਈ ਆਮ RT-PCR ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹਨ।ਜੇਕਰ ਪ੍ਰਯੋਗਸ਼ਾਲਾ ਵਿੱਚ ਪੈਸੇ ਦੀ ਕਮੀ ਨਹੀਂ ਹੈ, ਤਾਂ ਪਿਘਲਣ ਵਾਲੇ ਵਕਰ ਦੁਆਰਾ ਇੱਕ ਵਾਰ ਸਾਰੇ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਦੀ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕੀਤੀ ਜਾ ਸਕਦੀ ਹੈ।
4 ਕੀ ਤੁਹਾਨੂੰ ਯਕੀਨ ਹੈ ਕਿ ਤੁਹਾਡੀਆਂ ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਸਥਿਤੀਆਂ ਅਨੁਕੂਲ ਹਨ?
SYBR ਨੂੰ ਤੇਜ਼ ਰੋਸ਼ਨੀ ਤੋਂ ਸੁਰੱਖਿਅਤ ਰੱਖਿਆ ਜਾਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ, ਇਸਲਈ SYBR ਰੀਐਜੈਂਟ ਨੂੰ ਜੋੜਦੇ ਸਮੇਂ ਓਵਰਹੈੱਡ ਲਾਈਟ ਨੂੰ ਬੰਦ ਕਰਨ ਦੀ ਕੋਸ਼ਿਸ਼ ਕਰੋ, ਅਤੇ ਇਸਨੂੰ ਪੂਰਾ ਕਰਨ ਲਈ ਸਿਰਫ਼ ਮੱਧਮ ਰੌਸ਼ਨੀ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਨ ਦੀ ਲੋੜ ਹੈ।
SYBR ਨੂੰ 4°C 'ਤੇ ਸਟੋਰ ਕਰੋ।ਜਦੋਂ ਵਰਤੋਂ ਵਿੱਚ ਹੋਵੇ, ਫੋਮਿੰਗ ਤੋਂ ਬਚਣ ਲਈ ਚੰਗੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਰਲਾਉਣ ਲਈ ਹੌਲੀ-ਹੌਲੀ ਉੱਪਰ ਅਤੇ ਹੇਠਾਂ ਉਲਟਾਓ, ਅਤੇ ਜ਼ੋਰਦਾਰ ਢੰਗ ਨਾਲ ਘੁੰਮਾਓ ਨਾ।
ਕੁਝ ਛੋਟੀਆਂ ਭੈਣਾਂ ਨਮੂਨਿਆਂ ਨੂੰ ਮਿਲਾਉਣ ਦੇ ਡਰੋਂ ਪੀਸੀਆਰ ਬੋਰਡ 'ਤੇ ਨਿਸ਼ਾਨ ਲਗਾਉਣਾ ਪਸੰਦ ਕਰਦੀਆਂ ਹਨ, ਜੋ ਕਿ ਗਲਤ ਹੈ।ਕਿਉਂਕਿ ਤੁਹਾਡੇ ਮਾਰਕਰ ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਸਿਗਨਲਾਂ ਦੇ ਸੰਗ੍ਰਹਿ ਨੂੰ ਪ੍ਰਭਾਵਿਤ ਕਰਨ ਦੀ ਬਹੁਤ ਸੰਭਾਵਨਾ ਰੱਖਦੇ ਹਨ, ਮੈਂ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਜੂਨੀਅਰਾਂ ਨੂੰ ਮੈਮੋਰੀ ਵਿੱਚ ਸਹਾਇਤਾ ਕਰਨ ਲਈ ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਨੋਟਬੁੱਕਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਨ ਦੀ ਸਿਫ਼ਾਰਸ਼ ਕਰਦਾ ਹਾਂ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਹੇਠਾਂ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ।
ਚਿੱਤਰ.qRT-PCR ਨਮੂਨਾ ਲੋਡਿੰਗ ਡਾਇਗ੍ਰਾਮ
5 ਕੀ ਤੁਹਾਨੂੰ ਯਕੀਨ ਹੈ ਕਿ ਤੁਸੀਂ ਇਹ ਸਹੀ ਕਰ ਰਹੇ ਹੋ?
ਦਸਤਾਨੇ ਪਹਿਨੋ, ਦਸਤਾਨੇ ਪਹਿਨੋ, ਦਸਤਾਨੇ ਪਹਿਨੋ ਅਤੇ ਜ਼ਰੂਰੀ ਗੱਲਾਂ ਤਿੰਨ ਵਾਰ ਕਹੋ।
SYBR ਦੇ ਪ੍ਰਕਾਸ਼ ਨੂੰ ਘਟਾਉਣ ਲਈ, ਮੈਂ ਨਿੱਜੀ ਤੌਰ 'ਤੇ ਪਹਿਲਾਂ ਇੱਕ ਟੈਮਪਲੇਟ ਜੋੜਨਾ ਪਸੰਦ ਕਰਦਾ ਹਾਂ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਹੇਠਾਂ ਚਿੱਤਰ ਵਿੱਚ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ।ਤਜਰਬੇ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ, ਟੈਂਪਲੇਟ ਦੀ ਇੱਕ ਛੋਟੀ ਜਿਹੀ ਮਾਤਰਾ ਨੂੰ ਜੋੜਨ ਨਾਲ ਨਮੂਨੇ ਦੀਆਂ ਗਲਤੀਆਂ ਹੋਣ ਦੀ ਸੰਭਾਵਨਾ ਹੈ.ਇਸ ਲਈ, ਥੋੜ੍ਹੇ ਜਿਹੇ ਟੈਂਪਲੇਟ ਨੂੰ ਜੋੜਨ ਕਾਰਨ ਹੋਈ ਗਲਤੀ ਨੂੰ ਘੱਟ ਕਰਨ ਲਈ, ਮੈਂ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਨਮੂਨੇ ਨੂੰ ਦੁਬਾਰਾ ਦੁੱਗਣਾ ਕਰਦਾ ਹਾਂ, ਅਤੇ ਨਮੂਨੇ ਨੂੰ ਜੋੜਦੇ ਸਮੇਂ ਜੋੜੀ ਗਈ H2O2 ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਨੂੰ ਘਟਾਉਣ ਲਈ ਮਾਤਰਾ ਨੂੰ ਦੁੱਗਣਾ ਕਰਦਾ ਹਾਂ।
ਚਿੱਤਰ.qRT-PCR ਲੋਡਿੰਗ ਦਾ ਯੋਜਨਾਬੱਧ ਚਿੱਤਰ
ਫਿਰ ਹੇਠਾਂ ਦਿੱਤੇ ਅਨੁਸਾਰ qRT-PCR ਸਿਸਟਮ ਨੂੰ ਕੌਂਫਿਗਰ ਕਰੋ।
ਚਿੱਤਰ.qRT-PCR ਸਿਸਟਮ ਤਿਆਰੀ ਚਿੱਤਰ
ਨੋਟ: ਸੰਰਚਨਾ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਨੂੰ ਬਰਫ਼ 'ਤੇ ਕੀਤੇ ਜਾਣ ਦੀ ਲੋੜ ਹੈ।
ਨਮੂਨਾ ਜੋੜਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਪਾਰਦਰਸ਼ੀ ਸੀਲਿੰਗ ਫਿਲਮ ਨੂੰ ਪੇਸਟ ਕਰੋ।ਆਪਣੇ ਹੱਥਾਂ ਨਾਲ ਪਾਰਦਰਸ਼ੀ ਸੀਲਿੰਗ ਫਿਲਮ ਦੀ ਸਤਹ ਨੂੰ ਨਾ ਛੂਹਣ ਦੀ ਕੋਸ਼ਿਸ਼ ਕਰੋ, ਸਿਰਫ ਫਿਲਮ ਦੇ ਦੋਵੇਂ ਪਾਸੇ ਸਪੇਸ ਤੋਂ ਕੰਮ ਕਰੋ।ਕਿਉਂਕਿ ਫਿੰਗਰਪ੍ਰਿੰਟਸ ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਸਿਗਨਲਾਂ ਦੇ ਸੰਗ੍ਰਹਿ ਨੂੰ ਵੀ ਪ੍ਰਭਾਵਿਤ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹਨ।ਫਿਰ ਨਮੂਨੇ ਨੂੰ ਕੰਧ 'ਤੇ ਲਟਕਣ ਤੋਂ ਰੋਕਣ ਲਈ ਘੱਟ ਗਤੀ 'ਤੇ 10 ਸਕਿੰਟ ਲਈ ਤੇਜ਼ੀ ਨਾਲ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਜ ਕਰਨ ਲਈ ਸੈਂਟਰੀਫਿਊਜ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ।
ਸੰਬੰਧਿਤ ਉਤਪਾਦ:
ਪੋਸਟ ਟਾਈਮ: ਅਪ੍ਰੈਲ-28-2023
