一, ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਪ੍ਰਣਾਲੀ ਦੀ ਸੰਵੇਦਨਸ਼ੀਲਤਾ ਨੂੰ ਵਧਾਓ:

1. ਉੱਚ ਗੁਣਵੱਤਾ ਵਾਲੇ ਆਰਐਨਏ ਨੂੰ ਅਲੱਗ ਕਰੋ:

ਸਫਲ ਸੀਡੀਐਨਏ ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਉੱਚ-ਗੁਣਵੱਤਾ ਵਾਲੇ ਆਰਐਨਏ ਤੋਂ ਆਉਂਦਾ ਹੈ।ਉੱਚ-ਗੁਣਵੱਤਾ ਵਾਲਾ ਆਰਐਨਏ ਘੱਟੋ-ਘੱਟ ਪੂਰੀ-ਲੰਬਾਈ ਵਾਲਾ ਅਤੇ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟਸ ਇਨਿਹਿਬਟਰਾਂ ਜਿਵੇਂ ਕਿ EDTA ਜਾਂ SDS ਤੋਂ ਮੁਕਤ ਹੋਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ।ਆਰਐਨਏ ਦੀ ਗੁਣਵੱਤਾ ਕ੍ਰਮ ਜਾਣਕਾਰੀ ਦੀ ਵੱਧ ਤੋਂ ਵੱਧ ਮਾਤਰਾ ਨੂੰ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਦੀ ਹੈ ਜਿਸ ਨੂੰ ਤੁਸੀਂ cDNA ਵਿੱਚ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਾਈਬ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹੋ।ਇੱਕ ਆਮ RNA ਸ਼ੁੱਧੀਕਰਣ ਵਿਧੀ guanidine isothiocyanate/ acid phenol ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਇੱਕ-ਕਦਮ ਦੀ ਵਿਧੀ ਹੈ।RNase ਦੀ ਟਰੇਸ ਮਾਤਰਾ ਦੁਆਰਾ ਗੰਦਗੀ ਨੂੰ ਰੋਕਣ ਲਈ, RNase-ਅਮੀਰ ਨਮੂਨਿਆਂ (ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਪੈਨਕ੍ਰੀਅਸ) ਤੋਂ ਅਲੱਗ ਕੀਤੇ ਗਏ RNA ਨੂੰ ਉੱਚ-ਗੁਣਵੱਤਾ ਵਾਲੇ RNA ਨੂੰ ਸੁਰੱਖਿਅਤ ਰੱਖਣ ਲਈ, ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ ਲੰਬੇ ਸਮੇਂ ਲਈ ਸਟੋਰੇਜ ਲਈ ਫਾਰਮਲਡੀਹਾਈਡ ਵਿੱਚ ਸਟੋਰ ਕਰਨ ਦੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ।ਚੂਹੇ ਦੇ ਜਿਗਰ ਤੋਂ ਕੱਢਿਆ ਗਿਆ ਆਰਐਨਏ ਇੱਕ ਹਫ਼ਤੇ ਲਈ ਪਾਣੀ ਵਿੱਚ ਸਟੋਰ ਕਰਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਮੂਲ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਖਰਾਬ ਹੋ ਗਿਆ ਸੀ, ਜਦੋਂ ਕਿ ਚੂਹੇ ਦੀ ਤਿੱਲੀ ਤੋਂ ਕੱਢਿਆ ਗਿਆ ਆਰਐਨਏ 3 ਸਾਲਾਂ ਤੱਕ ਪਾਣੀ ਵਿੱਚ ਸਟੋਰ ਕਰਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਸਥਿਰ ਰਿਹਾ।ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਛੋਟੇ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟਾਂ ਨਾਲੋਂ 4 kb ਤੋਂ ਲੰਬੀਆਂ ਪ੍ਰਤੀਲਿਪੀਆਂ ਟਰੇਸ RNases ਦੁਆਰਾ ਡਿਗਰੇਡੇਸ਼ਨ ਲਈ ਵਧੇਰੇ ਸੰਵੇਦਨਸ਼ੀਲ ਹੁੰਦੀਆਂ ਹਨ।ਸਟੋਰ ਕੀਤੇ ਆਰਐਨਏ ਨਮੂਨਿਆਂ ਦੀ ਸਥਿਰਤਾ ਨੂੰ ਵਧਾਉਣ ਲਈ, ਆਰਐਨਏ ਨੂੰ ਡੀਓਨਾਈਜ਼ਡ ਫਾਰਮਾਮਾਈਡ ਵਿੱਚ ਭੰਗ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ ਅਤੇ -70 ਡਿਗਰੀ ਸੈਲਸੀਅਸ ਵਿੱਚ ਸਟੋਰ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਆਰਐਨਏ ਨੂੰ ਸੁਰੱਖਿਅਤ ਰੱਖਣ ਲਈ ਵਰਤਿਆ ਜਾਣ ਵਾਲਾ ਫੋਰਮਾਮਾਈਡ ਆਰਐਨਏ-ਡਿਗਰੇਡਿੰਗ ਮਲਬੇ ਤੋਂ ਮੁਕਤ ਹੋਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ।ਪੈਨਕ੍ਰੀਅਸ ਤੋਂ ਆਰਐਨਏ ਨੂੰ ਘੱਟੋ-ਘੱਟ ਇੱਕ ਸਾਲ ਲਈ ਫ਼ਾਰਮਾਈਡ ਵਿੱਚ ਸੁਰੱਖਿਅਤ ਰੱਖਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਆਰਐਨਏ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਨ ਦੀ ਤਿਆਰੀ ਕਰਦੇ ਸਮੇਂ, ਤੁਸੀਂ ਆਰਐਨਏ ਨੂੰ ਤੇਜ਼ ਕਰਨ ਲਈ ਹੇਠ ਲਿਖੀ ਵਿਧੀ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹੋ: NaCl ਨੂੰ 0.2M ਅਤੇ ਈਥਾਨੋਲ ਦੀ ਮਾਤਰਾ 4 ਗੁਣਾ ਵਿੱਚ ਜੋੜੋ, ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ 3-5 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ ਰੱਖੋ, ਅਤੇ 5 ਮਿੰਟ ਲਈ 10,000xg 'ਤੇ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਜ ਕਰੋ।

2. RNaseH-ਇਨਐਕਟਿਵ (RNaseH-) ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟਸ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ:

CDNA ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਦੀ ਲੰਬਾਈ ਅਤੇ ਉਪਜ ਨੂੰ ਵਧਾਉਣ ਲਈ RNase ਇਨਿਹਿਬਟਰਸ ਨੂੰ ਅਕਸਰ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਵਿੱਚ ਜੋੜਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।RNase ਇਨਿਹਿਬਟਰਸ ਨੂੰ ਇੱਕ ਬਫਰ ਅਤੇ ਇੱਕ ਘਟਾਉਣ ਵਾਲੇ ਏਜੰਟ (ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਡੀਟੀਟੀ) ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਵਿੱਚ ਪਹਿਲੀ-ਸਟ੍ਰੈਂਡ ਸਿੰਥੇਸਿਸ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਦੇ ਦੌਰਾਨ ਜੋੜਿਆ ਜਾਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ, ਕਿਉਂਕਿ ਸੀਡੀਐਨਏ ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ ਦੀ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਇਨਿਹਿਬਟਰ ਨੂੰ ਨਕਾਰਦੀ ਹੈ, ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ ਆਰਐਨਏ ਨੂੰ ਡੀਗਰੇਡ ਕਰ ਸਕਦੀ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ ਬਾਊਂਡ RNase ਨੂੰ ਜਾਰੀ ਕਰਦੀ ਹੈ।ਪ੍ਰੋਟੀਨ RNase ਇਨਿਹਿਬਟਰਸ ਸਿਰਫ RNase A, B, C ਦੁਆਰਾ RNA ਦੇ ਪਤਨ ਨੂੰ ਰੋਕਦੇ ਹਨ, ਅਤੇ ਚਮੜੀ 'ਤੇ RNase ਨੂੰ ਨਹੀਂ ਰੋਕਦੇ, ਇਸ ਲਈ ਸਾਵਧਾਨ ਰਹੋ ਕਿ ਇਹਨਾਂ ਇਨਿਹਿਬਟਰਸ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਦੇ ਬਾਵਜੂਦ ਆਪਣੀਆਂ ਉਂਗਲਾਂ ਤੋਂ RNase ਨੂੰ ਪੇਸ਼ ਨਾ ਕਰੋ।

ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟਸ ਆਰਐਨਏ ਦੇ ਸੀਡੀਐਨਏ ਵਿੱਚ ਪਰਿਵਰਤਨ ਨੂੰ ਉਤਪ੍ਰੇਰਿਤ ਕਰਦਾ ਹੈ।M-MLV ਅਤੇ AMV ਦੋਵਾਂ ਦੀ ਆਪਣੀ ਪੋਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਗਤੀਵਿਧੀ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ ਐਂਡੋਜੇਨਸ RNaseH ਗਤੀਵਿਧੀ ਹੈ।RNaseH ਗਤੀਵਿਧੀ ਅਤੇ ਪੌਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਗਤੀਵਿਧੀ RNA ਟੈਂਪਲੇਟ ਅਤੇ DNA ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਜਾਂ cDNA ਐਕਸਟੈਂਸ਼ਨ ਸਟ੍ਰੈਂਡ ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਬਣੇ ਹਾਈਬ੍ਰਿਡ ਸਟ੍ਰੈਂਡ ਲਈ ਇੱਕ ਦੂਜੇ ਨਾਲ ਮੁਕਾਬਲਾ ਕਰਦੇ ਹਨ, ਅਤੇ RNA:DNA ਕੰਪਲੈਕਸ ਵਿੱਚ RNA ਸਟ੍ਰੈਂਡ ਨੂੰ ਘਟਾਉਂਦੇ ਹਨ।RNaseH ਗਤੀਵਿਧੀ ਦੁਆਰਾ ਘਟਾਇਆ ਗਿਆ RNA ਟੈਂਪਲੇਟ ਹੁਣ cDNA ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਲਈ ਇੱਕ ਪ੍ਰਭਾਵਸ਼ਾਲੀ ਸਬਸਟਰੇਟ ਵਜੋਂ ਕੰਮ ਨਹੀਂ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਜੋ cDNA ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਦੀ ਉਪਜ ਅਤੇ ਲੰਬਾਈ ਨੂੰ ਘਟਾਉਂਦਾ ਹੈ।ਇਸ ਲਈ, ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟਸ ਦੀ RNaseH ਗਤੀਵਿਧੀ ਨੂੰ ਖਤਮ ਕਰਨਾ ਜਾਂ ਬਹੁਤ ਘੱਟ ਕਰਨਾ ਲਾਭਦਾਇਕ ਹੋਵੇਗਾ।

ਸੁਪਰਸਕ੍ਰਿਪਟ Ⅱ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟੇਜ, RNaseH- MMLV ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟੇਜ ਅਤੇ ਥਰਮੋਸਕ੍ਰਿਪਟ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟੇਜ, RNaseH- AMV, MMLV ਅਤੇ AMV ਨਾਲੋਂ ਵੱਧ ਮਾਤਰਾ ਅਤੇ ਵੱਧ ਪੂਰੀ-ਲੰਬਾਈ ਵਾਲੇ cDNA ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹਨ।RT-PCR ਸੰਵੇਦਨਸ਼ੀਲਤਾ cDNA ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਦੁਆਰਾ ਪ੍ਰਭਾਵਿਤ ਹੋਵੇਗੀ।ThermoScript AMV ਨਾਲੋਂ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਸੰਵੇਦਨਸ਼ੀਲ ਹੈ।RT-PCR ਉਤਪਾਦਾਂ ਦਾ ਆਕਾਰ ਸੀਡੀਐਨਏ ਨੂੰ ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਕਰਨ ਲਈ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟੇਜ ਦੀ ਯੋਗਤਾ ਦੁਆਰਾ ਸੀਮਿਤ ਹੈ, ਖਾਸ ਕਰਕੇ ਜਦੋਂ ਵੱਡੇ ਸੀਡੀਐਨਏ ਦੀ ਕਲੋਨਿੰਗ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ।MMLV ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ, SuperScripⅡ ਨੇ ਲੰਬੇ RT-PCR ਉਤਪਾਦਾਂ ਦੀ ਪੈਦਾਵਾਰ ਵਿੱਚ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਵਾਧਾ ਕੀਤਾ ਹੈ।RNaseH-ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟਸ ਨੇ ਵੀ ਥਰਮੋਸਟੈਬਿਲਟੀ ਵਧਾ ਦਿੱਤੀ ਹੈ, ਇਸਲਈ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਆਮ 37-42°C ਤੋਂ ਵੱਧ ਤਾਪਮਾਨਾਂ 'ਤੇ ਕੀਤੀ ਜਾ ਸਕਦੀ ਹੈ।ਸੁਝਾਏ ਗਏ ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਦੀਆਂ ਸਥਿਤੀਆਂ ਦੇ ਤਹਿਤ, oligo(dT) ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਅਤੇ [α-P]dCTP ਦੇ 10 μCi ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ।ਪਹਿਲੇ ਸਟ੍ਰੈਂਡ ਦੀ ਕੁੱਲ ਉਪਜ ਦੀ ਗਣਨਾ TCA ਵਰਖਾ ਵਿਧੀ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਪੂਰੀ-ਲੰਬਾਈ ਦੇ cDNA ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਆਕਾਰ-ਕ੍ਰਮਬੱਧ ਬੈਂਡਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਇੱਕ ਖਾਰੀ ਐਗਰੋਸ ਜੈੱਲ 'ਤੇ ਗਿਣਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।

3. ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਲਈ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਤਾਪਮਾਨ ਵਧਾਓ:

ਇੱਕ ਉੱਚ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਤਾਪਮਾਨ RNA ਸੈਕੰਡਰੀ ਢਾਂਚੇ ਨੂੰ ਖੋਲ੍ਹਣ ਵਿੱਚ ਮਦਦ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਦੀ ਪੈਦਾਵਾਰ ਨੂੰ ਵਧਾਉਂਦਾ ਹੈ।ਜ਼ਿਆਦਾਤਰ ਆਰਐਨਏ ਟੈਂਪਲੇਟਾਂ ਲਈ, ਆਰਐਨਏ ਅਤੇ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਨੂੰ ਬਫਰ ਜਾਂ ਲੂਣ ਤੋਂ ਬਿਨਾਂ 65°C 'ਤੇ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕਰਨਾ, ਇਸ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਬਰਫ਼ 'ਤੇ ਤੇਜ਼ੀ ਨਾਲ ਠੰਢਾ ਹੋਣਾ ਜ਼ਿਆਦਾਤਰ ਸੈਕੰਡਰੀ ਬਣਤਰਾਂ ਨੂੰ ਖਤਮ ਕਰ ਦੇਵੇਗਾ ਅਤੇ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਨੂੰ ਬੰਨ੍ਹਣ ਦੇਵੇਗਾ।ਹਾਲਾਂਕਿ, ਕੁਝ ਟੈਂਪਲੇਟਾਂ ਵਿੱਚ ਅਜੇ ਵੀ ਸੈਕੰਡਰੀ ਬਣਤਰ ਹਨ, ਭਾਵੇਂ ਹੀਟ ਵਿਨਾਸ਼ਕਾਰੀ ਹੋਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਵੀ।ਇਹਨਾਂ ਔਖੇ ਟੈਂਪਲੇਟਾਂ ਦਾ ਵਿਸਤਾਰ ਥਰਮੋਸਕ੍ਰਿਪਟ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟੇਜ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਨੂੰ ਬਿਹਤਰ ਬਣਾਉਣ ਲਈ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਨੂੰ ਉੱਚ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ ਰੱਖ ਕੇ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਉੱਚ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਤਾਪਮਾਨ ਵੀ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਨੂੰ ਵਧਾ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਖਾਸ ਕਰਕੇ ਜਦੋਂ ਜੀਨ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਪ੍ਰਾਈਮਰ (GSP) ਦੀ ਵਰਤੋਂ cDNA ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਲਈ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ (ਅਧਿਆਇ 3 ਦੇਖੋ)।ਜੇਕਰ GSP ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰ ਰਹੇ ਹੋ, ਤਾਂ ਯਕੀਨੀ ਬਣਾਓ ਕਿ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਦਾ Tm ਸੰਭਾਵਿਤ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਤਾਪਮਾਨ ਦੇ ਸਮਾਨ ਹੈ।ਓਲੀਗੋ(dT) ਅਤੇ 60°C ਤੋਂ ਉੱਪਰ ਬੇਤਰਤੀਬ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਨਾ ਵਰਤੋ।ਬੇਤਰਤੀਬ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਨੂੰ 60 ਡਿਗਰੀ ਸੈਲਸੀਅਸ ਤੱਕ ਵਧਾਉਣ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ 10 ਮਿੰਟ ਲਈ 25°C 'ਤੇ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕਰਨ ਦੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ।ਉੱਚ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਤਾਪਮਾਨ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਨ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, RNA/ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਮਿਸ਼ਰਣ ਨੂੰ 65°C ਵਿਨਾਸ਼ਕਾਰੀ ਤਾਪਮਾਨ ਤੋਂ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਇਨਕਿਊਬੇਸ਼ਨ ਤਾਪਮਾਨ ਵਿੱਚ ਸਿੱਧੇ ਟ੍ਰਾਂਸਫਰ ਕਰਕੇ ਅਤੇ ਪ੍ਰੀ-ਗਰਮ 2× ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਮਿਸ਼ਰਣ (cDNA ਹੌਟ-ਸਟਾਰਟ ਸਿੰਥੇਸਿਸ) ਜੋੜ ਕੇ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਨੂੰ ਵੀ ਸੁਧਾਰਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਇਹ ਪਹੁੰਚ ਇੰਟਰਮੋਲੀਕਿਊਲਰ ਬੇਸ ਪੇਅਰਿੰਗ ਨੂੰ ਰੋਕਣ ਵਿੱਚ ਮਦਦ ਕਰਦੀ ਹੈ ਜੋ ਹੇਠਲੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ ਹੁੰਦੀ ਹੈ।RT-PCR ਲਈ ਲੋੜੀਂਦੇ ਮਲਟੀਪਲ ਤਾਪਮਾਨ ਸਵਿਚਿੰਗ ਨੂੰ ਥਰਮਲ ਸਾਈਕਲਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਸਰਲ ਬਣਾਇਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।

Tth ਥਰਮੋਸਟਬਲ ਪੋਲੀਮੇਰੇਜ਼ Mg2+ ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਵਿੱਚ ਇੱਕ DNA ਪੋਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਅਤੇ Mn2+ ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਵਿੱਚ ਇੱਕ RNA ਪੋਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਦੇ ਤੌਰ ਤੇ ਕੰਮ ਕਰਦਾ ਹੈ।ਇਸ ਨੂੰ ਵੱਧ ਤੋਂ ਵੱਧ 65 ਡਿਗਰੀ ਸੈਲਸੀਅਸ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ ਗਰਮ ਰੱਖਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਹਾਲਾਂਕਿ, ਪੀਸੀਆਰ ਦੇ ਦੌਰਾਨ Mn2+ ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਵਫ਼ਾਦਾਰੀ ਨੂੰ ਘਟਾਉਂਦੀ ਹੈ, ਜੋ Tth ਪੌਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਨੂੰ ਉੱਚ-ਸ਼ੁੱਧਤਾ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ cDNA ਦੀ ਕਲੋਨਿੰਗ ਲਈ ਘੱਟ ਢੁਕਵਾਂ ਬਣਾਉਂਦਾ ਹੈ।ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, Tth ਵਿੱਚ ਘੱਟ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਹੈ, ਜੋ ਸੰਵੇਦਨਸ਼ੀਲਤਾ ਨੂੰ ਘਟਾਉਂਦੀ ਹੈ, ਅਤੇ, ਕਿਉਂਕਿ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਅਤੇ ਪੀਸੀਆਰ ਇੱਕ ਸਿੰਗਲ ਐਂਜ਼ਾਈਮ ਨਾਲ ਕੀਤੇ ਜਾ ਸਕਦੇ ਹਨ, ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਤੋਂ ਬਿਨਾਂ ਨਿਯੰਤਰਣ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਜੀਨੋਮਿਕ ਡੀਐਨਏ ਨੂੰ ਦੂਸ਼ਿਤ ਕਰਨ ਵਾਲੇ ਸੀਡੀਐਨਏ ਐਂਪਲੀਫੀਕੇਸ਼ਨ ਉਤਪਾਦਾਂ ਦੀ ਤੁਲਨਾ ਕਰਨ ਲਈ ਨਹੀਂ ਕੀਤੀ ਜਾ ਸਕਦੀ।ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਉਤਪਾਦਾਂ ਨੂੰ ਵੱਖ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।

4. ਐਡੀਟਿਵ ਜੋ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਨੂੰ ਉਤਸ਼ਾਹਿਤ ਕਰਦੇ ਹਨ:

ਗਲਾਈਸਰੋਲ ਅਤੇ ਡੀਐਮਐਸਓ ਸਮੇਤ ਜੋੜਾਂ ਨੂੰ ਪਹਿਲੀ-ਸਟ੍ਰੈਂਡ ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਵਿੱਚ ਜੋੜਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ ਨਿਊਕਲੀਕ ਐਸਿਡ ਡਬਲ-ਸਟ੍ਰੈਂਡ ਦੀ ਸਥਿਰਤਾ ਨੂੰ ਘਟਾ ਸਕਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਆਰਐਨਏ ਦੀ ਸੈਕੰਡਰੀ ਬਣਤਰ ਨੂੰ ਖੋਲ੍ਹ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਸੁਪਰਸਕ੍ਰਿਪਟ II ਜਾਂ MMLV ਗਤੀਵਿਧੀ ਨੂੰ ਪ੍ਰਭਾਵਿਤ ਕੀਤੇ ਬਿਨਾਂ 20% ਗਲਾਈਸਰੋਲ ਜਾਂ 10% DMSO ਜੋੜਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।AMV ਗਤੀਵਿਧੀ ਦੇ ਨੁਕਸਾਨ ਤੋਂ ਬਿਨਾਂ 20% ਗਲਾਈਸਰੋਲ ਨੂੰ ਵੀ ਬਰਦਾਸ਼ਤ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਸੁਪਰਸਕ੍ਰਿਪਟⅡ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਵਿੱਚ RT-PCR ਦੀ ਸੰਵੇਦਨਸ਼ੀਲਤਾ ਨੂੰ ਵੱਧ ਤੋਂ ਵੱਧ ਕਰਨ ਲਈ, 10% ਗਲਾਈਸਰੋਲ ਨੂੰ ਜੋੜਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ ਅਤੇ 45 ਡਿਗਰੀ ਸੈਲਸੀਅਸ 'ਤੇ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਜੇ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਉਤਪਾਦ ਦਾ 1/10 ਪੀਸੀਆਰ ਵਿੱਚ ਜੋੜਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਤਾਂ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਵਿੱਚ ਗਲਾਈਸਰੋਲ ਦੀ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ 0.4% ਹੈ, ਜੋ ਪੀਸੀਆਰ ਨੂੰ ਰੋਕਣ ਲਈ ਕਾਫ਼ੀ ਨਹੀਂ ਹੈ।

5. RNaseH ਇਲਾਜ:

PCR ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ RNaseH ਨਾਲ cDNA ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਦਾ ਇਲਾਜ ਸੰਵੇਦਨਸ਼ੀਲਤਾ ਨੂੰ ਵਧਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਕੁਝ ਟੈਂਪਲੇਟਾਂ ਲਈ, ਇਹ ਸੋਚਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਸੀਡੀਐਨਏ ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਵਿੱਚ ਆਰਐਨਏ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਉਤਪਾਦਾਂ ਦੇ ਬਾਈਡਿੰਗ ਨੂੰ ਰੋਕਦਾ ਹੈ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ RNaseH ਇਲਾਜ ਸੰਵੇਦਨਸ਼ੀਲਤਾ ਨੂੰ ਵਧਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ, RNaseH ਇਲਾਜ ਜ਼ਰੂਰੀ ਹੁੰਦਾ ਹੈ ਜਦੋਂ ਲੰਬੇ ਪੂਰੀ-ਲੰਬਾਈ ਵਾਲੇ cDNA ਟਾਰਗੇਟ ਟੈਂਪਲੇਟਾਂ ਨੂੰ ਵਧਾਇਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਘੱਟ-ਕਾਪੀ ਟਿਊਬਰਸ ਸਕਰੋਸਿਸ II।ਇਸ ਮੁਸ਼ਕਲ ਟੈਂਪਲੇਟ ਲਈ, RNaseH ਇਲਾਜ ਨੇ ਸੁਪਰਸਕ੍ਰਿਪਟ II ਜਾਂ AMV-ਸਿੰਥੇਸਾਈਜ਼ਡ cDNA ਦੁਆਰਾ ਪੈਦਾ ਕੀਤੇ ਸਿਗਨਲ ਨੂੰ ਵਧਾਇਆ।ਜ਼ਿਆਦਾਤਰ RT-PCR ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਲਈ, RNaseH ਇਲਾਜ ਵਿਕਲਪਿਕ ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਕਿਉਂਕਿ 95°C 'ਤੇ ਪੀਸੀਆਰ ਵਿਨਾਸ਼ਕਾਰੀ ਪੜਾਅ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ RNA:DNA ਕੰਪਲੈਕਸ ਵਿੱਚ RNA ਨੂੰ ਹਾਈਡ੍ਰੋਲਾਈਜ਼ ਕਰਦਾ ਹੈ।

6. ਛੋਟੇ ਆਰਐਨਏ ਖੋਜ ਵਿਧੀ ਵਿੱਚ ਸੁਧਾਰ:

ਆਰਟੀ-ਪੀਸੀਆਰ ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ ਚੁਣੌਤੀਪੂਰਨ ਹੁੰਦਾ ਹੈ ਜਦੋਂ ਸਿਰਫ ਥੋੜ੍ਹੀ ਮਾਤਰਾ ਵਿੱਚ ਆਰਐਨਏ ਉਪਲਬਧ ਹੁੰਦੇ ਹਨ।RNA ਅਲੱਗ-ਥਲੱਗ ਦੌਰਾਨ ਇੱਕ ਕੈਰੀਅਰ ਵਜੋਂ ਸ਼ਾਮਲ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਗਲਾਈਕੋਜਨ ਛੋਟੇ ਨਮੂਨਿਆਂ ਦੀ ਪੈਦਾਵਾਰ ਨੂੰ ਵਧਾਉਣ ਵਿੱਚ ਮਦਦ ਕਰਦਾ ਹੈ।RNase-ਮੁਕਤ ਗਲਾਈਕੋਜਨ ਨੂੰ ਟ੍ਰਾਈਜ਼ੋਲ ਨੂੰ ਜੋੜਨ ਦੇ ਨਾਲ ਹੀ ਜੋੜਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਗਲਾਈਕੋਜਨ ਪਾਣੀ ਵਿੱਚ ਘੁਲਣਸ਼ੀਲ ਹੈ ਅਤੇ ਬਾਅਦ ਵਿੱਚ ਵਰਖਾ ਦੀ ਸਹਾਇਤਾ ਲਈ ਆਰਐਨਏ ਨਾਲ ਜਲਮਈ ਪੜਾਅ ਵਿੱਚ ਰੱਖਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।50 ਮਿਲੀਗ੍ਰਾਮ ਟਿਸ਼ੂ ਜਾਂ 106 ਸੰਸਕ੍ਰਿਤ ਸੈੱਲਾਂ ਤੋਂ ਘੱਟ ਨਮੂਨਿਆਂ ਲਈ, RNase-ਮੁਕਤ ਗਲਾਈਕੋਜਨ ਦੀ ਸਿਫ਼ਾਰਸ਼ ਕੀਤੀ ਇਕਾਗਰਤਾ 250 μg/ml ਹੈ।

ਸੁਪਰਸਕ੍ਰਿਪਟ II ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਵਿੱਚ ਐਸੀਟਿਲਟਿਡ ਬੀਐਸਏ ਨੂੰ ਜੋੜਨਾ ਸੰਵੇਦਨਸ਼ੀਲਤਾ ਨੂੰ ਵਧਾ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਆਰਐਨਏ ਦੀ ਛੋਟੀ ਮਾਤਰਾ ਲਈ, ਸੁਪਰਸਕ੍ਰਿਪਟ II ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਨੂੰ ਘਟਾਉਣਾ ਅਤੇ RNaseOut ਨਿਊਕਲੀਜ਼ ਇਨ੍ਹੀਬੀਟਰ ਦੀਆਂ 40 ਯੂਨਿਟਾਂ ਨੂੰ ਜੋੜਨਾ ਖੋਜ ਦੇ ਪੱਧਰ ਨੂੰ ਵਧਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਜੇਕਰ ਗਲਾਈਕੋਜਨ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਆਰਐਨਏ ਆਈਸੋਲੇਸ਼ਨ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਵਿੱਚ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ, ਤਾਂ ਵੀ ਉਲਟ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਲਈ ਸੁਪਰਸਕ੍ਰਿਪਟ II ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਸਮੇਂ BSA ਜਾਂ RNase ਇਨਿਹਿਬਟਰ ਨੂੰ ਜੋੜਨ ਦੀ ਸਿਫਾਰਸ਼ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ।

二、RT-PCR ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਵਧਾਓ

1. CND ਅਸਿੰਥੇਸਿਸ:

ਫਸਟ-ਸਟ੍ਰੈਂਡ cDNA ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਨੂੰ ਤਿੰਨ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਤਰੀਕਿਆਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਸ਼ੁਰੂ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਜਿਸ ਦੀ ਸਾਪੇਖਿਕ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਸੀਡੀਐਨਏ ਸੰਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਅਤੇ ਕਿਸਮ ਨੂੰ ਪ੍ਰਭਾਵਿਤ ਕਰਦੀ ਹੈ।

ਬੇਤਰਤੀਬ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਵਿਧੀ ਤਿੰਨ ਤਰੀਕਿਆਂ ਵਿੱਚੋਂ ਸਭ ਤੋਂ ਘੱਟ ਖਾਸ ਸੀ।ਛੋਟੇ, ਅੰਸ਼ਕ-ਲੰਬਾਈ ਵਾਲੇ cDNAs ਪੈਦਾ ਕਰਦੇ ਹੋਏ, ਪੂਰੇ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟ ਦੌਰਾਨ ਕਈ ਸਾਈਟਾਂ 'ਤੇ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਐਨੀਲ ਕਰਦੇ ਹਨ।ਇਹ ਵਿਧੀ ਅਕਸਰ 5′ ਅੰਤ ਦੇ ਕ੍ਰਮ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਨ ਅਤੇ ਸੈਕੰਡਰੀ ਬਣਤਰ ਦੇ ਖੇਤਰਾਂ ਜਾਂ ਸਮਾਪਤੀ ਸਾਈਟਾਂ ਦੇ ਨਾਲ RNA ਟੈਂਪਲੇਟਾਂ ਤੋਂ cDNA ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਨ ਲਈ ਵਰਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ ਜੋ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟਸ ਦੁਆਰਾ ਨਕਲ ਨਹੀਂ ਕੀਤੀ ਜਾ ਸਕਦੀ।ਸਭ ਤੋਂ ਲੰਬਾ cDNA ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਨ ਲਈ, ਹਰੇਕ RNA ਨਮੂਨੇ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਦੇ RNA ਅਤੇ ਅਨੁਪਾਤ ਨੂੰ ਅਨੁਭਵੀ ਤੌਰ 'ਤੇ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨ ਦੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ।ਬੇਤਰਤੀਬ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਦੀ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਪ੍ਰਤੀ 20 μl ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ 50 ਤੋਂ 250 ng ਤੱਕ ਸੀ।ਕਿਉਂਕਿ ਬੇਤਰਤੀਬ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਕੁੱਲ RNA ਤੋਂ ਸੰਸ਼ਲੇਸ਼ਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ cDNA ਮੁੱਖ ਤੌਰ 'ਤੇ ਰਿਬੋਸੋਮਲ RNA ਹੈ, ਪੌਲੀ(A)+RNA ਨੂੰ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਟੈਪਲੇਟ ਵਜੋਂ ਚੁਣਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।

Oligo(dT) ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਬੇਤਰਤੀਬ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਨਾਲੋਂ ਵਧੇਰੇ ਖਾਸ ਹੁੰਦੇ ਹਨ।ਇਹ ਜ਼ਿਆਦਾਤਰ ਯੂਕੇਰੀਓਟਿਕ mRNAs ਦੇ 3′ ਸਿਰੇ 'ਤੇ ਪਾਈ ਗਈ ਪੌਲੀ(A) ਪੂਛ ਨੂੰ ਹਾਈਬ੍ਰਿਡਾਈਜ਼ ਕਰਦਾ ਹੈ।ਕਿਉਂਕਿ ਪੌਲੀ(A)+ RNA ਕੁੱਲ RNA ਦਾ ਲਗਭਗ 1% ਤੋਂ 2% ਹੈ, cDNA ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਅਤੇ ਗੁੰਝਲਤਾ ਬੇਤਰਤੀਬ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਨਾਲੋਂ ਬਹੁਤ ਘੱਟ ਹੈ।ਇਸਦੀ ਉੱਚ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਦੇ ਕਾਰਨ, ਓਲੀਗੋ(dT) ਨੂੰ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਅਤੇ ਪੌਲੀ(A)+ ਚੋਣ ਲਈ RNA ਦੇ ਅਨੁਪਾਤ ਦੇ ਅਨੁਕੂਲਨ ਦੀ ਲੋੜ ਨਹੀਂ ਹੁੰਦੀ ਹੈ।0.5μg oligo(dT) ਪ੍ਰਤੀ 20μl ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਪ੍ਰਣਾਲੀ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਨ ਦੀ ਸਿਫਾਰਸ਼ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ।oligo(dT)12-18 ਜ਼ਿਆਦਾਤਰ RT-PCR ਲਈ ਢੁਕਵਾਂ ਹੈ।ThermoScript RT-PCR ਸਿਸਟਮ ਉੱਚ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਤਾਪਮਾਨਾਂ ਲਈ ਇਸਦੀ ਬਿਹਤਰ ਥਰਮਲ ਸਥਿਰਤਾ ਦੇ ਕਾਰਨ oligo(dT)20 ਦੀ ਪੇਸ਼ਕਸ਼ ਕਰਦਾ ਹੈ।

ਜੀਨ ਸਪੈਸ਼ਲ ਪ੍ਰਾਈਮਰ (GSP) ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਸਟੈਪ ਲਈ ਸਭ ਤੋਂ ਖਾਸ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਹਨ।GSP ਇੱਕ ਐਂਟੀਸੈਂਸ ਓਲੀਗੋਨਿਊਕਲੀਓਟਾਈਡ ਹੈ ਜੋ ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ RNA ਟਾਰਗੇਟ ਕ੍ਰਮ ਨੂੰ ਹਾਈਬ੍ਰਿਡਾਈਜ਼ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਬੇਤਰਤੀਬ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਜਾਂ ਓਲੀਗੋ(dT) ਦੇ ਉਲਟ, ਜੋ ਸਾਰੇ RNAs ਨੂੰ ਜੋੜਦਾ ਹੈ।ਉਹੀ ਨਿਯਮ ਜੋ ਪੀਸੀਆਰ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਨੂੰ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਕਰਨ ਲਈ ਵਰਤੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਵਿੱਚ GSP ਦੇ ਡਿਜ਼ਾਈਨ 'ਤੇ ਲਾਗੂ ਹੁੰਦੇ ਹਨ।GSP ਐਂਪਲੀਫੀਕੇਸ਼ਨ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਦੇ ਸਮਾਨ ਕ੍ਰਮ ਹੋ ਸਕਦਾ ਹੈ ਜੋ mRNA ਦੇ 3′-ਸਭ ਤੋਂ ਵੱਧ ਸਿਰੇ ਨੂੰ ਐਨੀਲ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਜਾਂ GSP ਨੂੰ ਰਿਵਰਸ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਦੇ ਹੇਠਾਂ ਵੱਲ ਨੂੰ ਐਨੀਲ ਕਰਨ ਲਈ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਕੁਝ ਵਿਸਤ੍ਰਿਤ ਵਿਸ਼ਿਆਂ ਲਈ, ਸਫਲ RT-PCR ਲਈ ਇੱਕ ਤੋਂ ਵੱਧ ਐਂਟੀਸੈਂਸ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਤਿਆਰ ਕੀਤੇ ਜਾਣ ਦੀ ਲੋੜ ਹੈ ਕਿਉਂਕਿ ਟੀਚਾ RNA ਦੀ ਸੈਕੰਡਰੀ ਬਣਤਰ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਬਾਈਡਿੰਗ ਨੂੰ ਰੋਕ ਸਕਦੀ ਹੈ।20 μl ਫਸਟ-ਸਟ੍ਰੈਂਡ ਸਿੰਥੇਸਿਸ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਵਿੱਚ 1 pmol ਐਂਟੀਸੈਂਸ GSP ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਨ ਦੀ ਸਿਫਾਰਸ਼ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ।

2. ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਲਈ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਤਾਪਮਾਨ ਵਧਾਓ:

ਜੀਐਸਪੀ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਦਾ ਪੂਰਾ ਲਾਭ ਲੈਣ ਲਈ, ਉੱਚ ਥਰਮੋਸਟੈਬਿਲਟੀ ਦੇ ਨਾਲ ਇੱਕ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟਸ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਜਾਣੀ ਚਾਹੀਦੀ ਹੈ।ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਦੀ ਸਖਤੀ ਨੂੰ ਵਧਾਉਣ ਲਈ ਥਰਮੋਸਟਬਲ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟਸ ਨੂੰ ਉੱਚ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਉਦਾਹਰਨ ਲਈ, ਜੇਕਰ ਇੱਕ GSP 55°C 'ਤੇ ਐਨੀਲ ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਤਾਂ GSP ਦੀ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਪੂਰੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਨਹੀਂ ਵਰਤੀ ਜਾਵੇਗੀ ਜੇਕਰ AMV ਜਾਂ M-MLV ਨੂੰ 37°C ਦੀ ਘੱਟ ਸਖਤਤਾ 'ਤੇ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਲਈ ਵਰਤਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਹਾਲਾਂਕਿ, SuperScript II ਅਤੇ ThermoScript ਨੂੰ 50°C ਜਾਂ ਵੱਧ 'ਤੇ ਪ੍ਰਤੀਕਿਰਿਆ ਦਿੱਤੀ ਜਾ ਸਕਦੀ ਹੈ, ਜੋ ਘੱਟ ਤਾਪਮਾਨਾਂ 'ਤੇ ਉਤਪੰਨ ਗੈਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਉਤਪਾਦਾਂ ਨੂੰ ਖਤਮ ਕਰ ਦੇਵੇਗੀ।ਵੱਧ ਤੋਂ ਵੱਧ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਲਈ, ਆਰਐਨਏ/ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਮਿਸ਼ਰਣ ਨੂੰ 65°C ਵਿਨਾਸ਼ਕਾਰੀ ਤਾਪਮਾਨ ਤੋਂ ਉਲਟ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਇਨਕਿਊਬੇਸ਼ਨ ਤਾਪਮਾਨ ਵਿੱਚ ਸਿੱਧਾ ਟ੍ਰਾਂਸਫਰ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਪ੍ਰੀ-ਗਰਮ 2× ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਮਿਸ਼ਰਣ (cDNA ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਹਾਟ ਸਟਾਰਟ) ਵਿੱਚ ਜੋੜਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਇਹ ਘੱਟ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ ਇੰਟਰਮੋਲੀਕਿਊਲਰ ਬੇਸ ਪੇਅਰਿੰਗ ਨੂੰ ਰੋਕਣ ਵਿੱਚ ਮਦਦ ਕਰਦਾ ਹੈ।RT-PCR ਲਈ ਲੋੜੀਂਦੇ ਮਲਟੀਪਲ ਤਾਪਮਾਨ ਪਰਿਵਰਤਨ ਨੂੰ ਥਰਮਲ ਸਾਈਕਲਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਸਰਲ ਬਣਾਇਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।

3. ਜੀਨੋਮਿਕ ਡੀਐਨਏ ਗੰਦਗੀ ਨੂੰ ਘਟਾਉਂਦਾ ਹੈ:

RT-PCR ਦੇ ਨਾਲ ਆਈ ਇੱਕ ਸੰਭਾਵੀ ਮੁਸ਼ਕਲ ਆਰਐਨਏ ਵਿੱਚ ਜੀਨੋਮਿਕ ਡੀਐਨਏ ਦਾ ਗੰਦਗੀ ਹੈ।ਇੱਕ ਚੰਗੀ ਆਰਐਨਏ ਆਈਸੋਲੇਸ਼ਨ ਵਿਧੀ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਨਾ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਟ੍ਰਾਈਜ਼ੋਲ ਰੀਏਜੈਂਟ, ਆਰਐਨਏ ਦੀ ਤਿਆਰੀ ਨੂੰ ਦੂਸ਼ਿਤ ਕਰਨ ਵਾਲੇ ਜੀਨੋਮਿਕ ਡੀਐਨਏ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਨੂੰ ਘਟਾ ਦੇਵੇਗਾ।ਜੀਨੋਮਿਕ ਡੀਐਨਏ ਤੋਂ ਪ੍ਰਾਪਤ ਉਤਪਾਦਾਂ ਤੋਂ ਬਚਣ ਲਈ, ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ ਦੂਸ਼ਿਤ ਡੀਐਨਏ ਨੂੰ ਹਟਾਉਣ ਲਈ ਆਰਐਨਏ ਨੂੰ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ-ਗ੍ਰੇਡ ਡੀਐਨਏਜ਼ I ਨਾਲ ਇਲਾਜ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਨਮੂਨਿਆਂ ਨੂੰ 2.0 mM EDTA ਵਿੱਚ 10 ਮਿੰਟ ਲਈ 65°C 'ਤੇ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕਰਕੇ DNase I ਪਾਚਨ ਨੂੰ ਖਤਮ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।EDTA ਉੱਚ ਤਾਪਮਾਨਾਂ 'ਤੇ ਮੈਗਨੀਸ਼ੀਅਮ ਆਇਨ-ਨਿਰਭਰ ਆਰਐਨਏ ਹਾਈਡੋਲਿਸਿਸ ਨੂੰ ਰੋਕ ਕੇ, ਮੈਗਨੀਸ਼ੀਅਮ ਆਇਨਾਂ ਨੂੰ ਚੇਲੇਟ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ।

ਐਂਪਲੀਫਾਈਡ ਸੀਡੀਐਨਏ ਨੂੰ ਜੀਨੋਮਿਕ ਡੀਐਨਏ ਐਂਪਲੀਫੀਕੇਸ਼ਨ ਉਤਪਾਦਾਂ ਨੂੰ ਦੂਸ਼ਿਤ ਕਰਨ ਤੋਂ ਵੱਖ ਕਰਨ ਲਈ, ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਨੂੰ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ ਕਿ ਹਰੇਕ ਐਨੀਲ ਐਕਸੌਨ ਨੂੰ ਵੱਖਰਾ ਕਰੇ।ਸੀਡੀਐਨਏ ਤੋਂ ਲਏ ਗਏ ਪੀਸੀਆਰ ਉਤਪਾਦ ਦੂਸ਼ਿਤ ਜੀਨੋਮਿਕ ਡੀਐਨਏ ਤੋਂ ਲਏ ਗਏ ਉਤਪਾਦਾਂ ਨਾਲੋਂ ਛੋਟੇ ਹੋਣਗੇ।ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਹਰੇਕ ਆਰਐਨਏ ਟੈਂਪਲੇਟ 'ਤੇ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਤੋਂ ਬਿਨਾਂ ਇੱਕ ਨਿਯੰਤਰਣ ਪ੍ਰਯੋਗ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਤਾਂ ਜੋ ਇਹ ਪਤਾ ਲਗਾਇਆ ਜਾ ਸਕੇ ਕਿ ਕੀ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਟੁਕੜਾ ਜੀਨੋਮਿਕ ਡੀਐਨਏ ਜਾਂ ਸੀਡੀਐਨਏ ਤੋਂ ਲਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਤੋਂ ਬਿਨਾਂ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤਾ ਪੀਸੀਆਰ ਉਤਪਾਦ ਜੀਨੋਮ ਤੋਂ ਲਿਆ ਗਿਆ ਹੈ।