Ⅰ. ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਪ੍ਰਣਾਲੀ ਦੀ ਸੰਵੇਦਨਸ਼ੀਲਤਾ ਨੂੰ ਵਧਾਓ:
1. ਉੱਚ-ਗੁਣਵੱਤਾ ਵਾਲੇ RNA ਨੂੰ ਵੱਖ ਕਰੋ:
ਸਫਲ cDNA ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਉੱਚ-ਗੁਣਵੱਤਾ ਵਾਲੇ RNA ਤੋਂ ਆਉਂਦਾ ਹੈ।ਉੱਚ-ਗੁਣਵੱਤਾ ਵਾਲੇ ਆਰਐਨਏ ਨੂੰ ਘੱਟੋ-ਘੱਟ ਕੁੱਲ ਲੰਬਾ ਯਕੀਨੀ ਬਣਾਉਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਇਸ ਵਿੱਚ ਇਨ੍ਹੀਬੀਟਰ ਨਹੀਂ ਹੁੰਦੇ ਜਿਨ੍ਹਾਂ ਵਿੱਚ ਰਿਕਾਰਡਿੰਗ ਐਨਜ਼ਾਈਮ ਨਹੀਂ ਹੁੰਦੇ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ EDTA ਜਾਂ SDS।RNA ਦੀ ਗੁਣਵੱਤਾ ਕ੍ਰਮ ਜਾਣਕਾਰੀ ਦਾ ਅਧਿਕਤਮ ਮੁੱਲ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਦੀ ਹੈ ਜੋ ਤੁਸੀਂ cDNA ਵਿੱਚ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਾਈਬ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹੋ।ਆਮ ਆਰਐਨਏ ਸ਼ੁੱਧੀਕਰਨ ਵਿਧੀ ਆਈਸੋਸਾਈਨੇਟ/ਐਸੀਡੋਫੇਨੋਲ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਨ ਦਾ ਇੱਕ ਪੜਾਅ ਤਰੀਕਾ ਹੈ।RNase ਦੇ ਪ੍ਰਦੂਸ਼ਣ ਨੂੰ ਰੋਕਣ ਲਈ, RNase (ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਪੈਨਕ੍ਰੀਅਸ) ਨਾਲ ਭਰਪੂਰ ਨਮੂਨੇ ਤੋਂ ਵੱਖ ਕੀਤੇ ਗਏ ਆਰਐਨਏ ਨੂੰ ਉੱਚ-ਗੁਣਵੱਤਾ ਵਾਲੇ ਆਰਐਨਏ ਨੂੰ ਬਚਾਉਣ ਲਈ ਫਾਰਮਲਡੀਹਾਈਡ ਦੀ ਸਟੋਰੇਜ ਦੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ, ਜੋ ਲੰਬੇ ਸਮੇਂ ਲਈ ਸਟੋਰੇਜ ਲਈ ਹੋਰ ਵੀ ਜ਼ਿਆਦਾ ਹੈ।ਚੂਹੇ ਦੇ ਜਿਗਰ ਤੋਂ ਕੱਢਿਆ ਗਿਆ ਆਰਐਨਏ ਮੂਲ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਪਾਣੀ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਹਫ਼ਤੇ ਦੇ ਸਟੋਰੇਜ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਖਰਾਬ ਹੋ ਗਿਆ ਸੀ, ਜਦੋਂ ਕਿ ਚੂਹੇ ਦੀ ਤਿੱਲੀ ਤੋਂ ਕੱਢਿਆ ਗਿਆ ਆਰਐਨਏ ਪਾਣੀ ਵਿੱਚ ਸਟੋਰੇਜ ਦੇ ਤਿੰਨ ਸਾਲਾਂ ਬਾਅਦ ਸਥਿਰ ਰਿਹਾ।ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, 4kb ਤੋਂ ਵੱਡੀਆਂ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟਾਂ ਛੋਟੀਆਂ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟਾਂ ਨਾਲੋਂ RNase ਡਿਗਰੇਡੇਸ਼ਨ ਨੂੰ ਟਰੇਸ ਕਰਨ ਲਈ ਵਧੇਰੇ ਸੰਵੇਦਨਸ਼ੀਲ ਹੁੰਦੀਆਂ ਹਨ।ਸਟੋਰੇਜ਼ ਆਰਐਨਏ ਨਮੂਨੇ ਦੀ ਸਥਿਰਤਾ ਨੂੰ ਵਧਾਉਣ ਲਈ, ਆਰਐਨਏ ਨੂੰ ਆਇਨ ਦੇ ਇੱਕ ਮੈਥਲਮਾਮਾਈਨ ਵਿੱਚ ਭੰਗ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ -70 °C ਸਟੋਰ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।RNA ਨੂੰ ਬਚਾਉਣ ਲਈ ਵਰਤੀ ਜਾਂਦੀ ਥਾਈਲਾਈਡ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਫੁਟਕਲ ਵਸਤੂ ਨਹੀਂ ਹੋਣੀ ਚਾਹੀਦੀ ਜੋ RNA ਨੂੰ ਘਟਾਉਂਦੀ ਹੈ।ਆਰਐਨਏ, ਜੋ ਪੈਨਕ੍ਰੀਅਸ ਤੋਂ ਲਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਨੂੰ ਘੱਟੋ-ਘੱਟ ਇੱਕ ਸਾਲ ਲਈ ਮੈਥੈਲਮਾਈਨ ਵਿੱਚ ਬਚਾਇਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਜਦੋਂ ਤੁਸੀਂ ਆਰਐਨਏ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਨ ਲਈ ਤਿਆਰ ਹੋ, ਤਾਂ ਤੁਸੀਂ ਆਰਐਨਏ ਨੂੰ ਤੇਜ਼ ਕਰਨ ਲਈ ਹੇਠਾਂ ਦਿੱਤੇ ਤਰੀਕਿਆਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹੋ: NaCl ਨੂੰ 0.2m ਅਤੇ ਈਥਾਨੋਲ ਦੀ 4 ਗੁਣਾ ਮਾਤਰਾ ਵਿੱਚ ਜੋੜੋ, ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ ਨੂੰ 3-5 ਮਿੰਟ ਲਈ ਰੱਖੋ, ਅਤੇ 5 ਮਿੰਟ ਲਈ 10,000 × g ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਗਲ।
2. RNaseH ਗਤੀਵਿਧੀ (RNaseH-) ਤੋਂ ਬਿਨਾਂ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟਸ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ:
CDNA ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਦੀ ਲੰਬਾਈ ਅਤੇ ਉਪਜ ਨੂੰ ਵਧਾਉਣ ਲਈ RNase ਇਨਿਹਿਬਟਰਸ ਨੂੰ ਅਕਸਰ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਵਿੱਚ ਜੋੜਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।RNase ਇਨਿਹਿਬਟਰ ਨੂੰ ਬਫਰਾਂ ਅਤੇ ਡੀਟੀਟੀ ਵਰਗੇ ਘਟਾਉਣ ਵਾਲੇ ਏਜੰਟਾਂ ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਵਿੱਚ ਪਹਿਲੀ ਚੇਨ ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਵਿੱਚ ਜੋੜਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਕਿਉਂਕਿ ਪੂਰਵ-cDNA ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਇਨਿਹਿਬਟਰ ਨੂੰ ਨਕਾਰਦੀ ਹੈ, ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ ਆਰਐਨਏ ਨੂੰ ਡੀਗਰੇਡ ਕਰਨ ਵਾਲੇ ਬੰਨ੍ਹੇ ਹੋਏ RNases ਨੂੰ ਜਾਰੀ ਕਰਦੇ ਹਨ।ਪ੍ਰੋਟੀਨ RNase ਇਨਿਹਿਬਟਰ ਸਿਰਫ RNase A, B, C ਦੁਆਰਾ RNA ਦੇ ਪਤਨ ਨੂੰ ਰੋਕਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਚਮੜੀ 'ਤੇ RNase ਨੂੰ ਨਹੀਂ ਰੋਕਦਾ, ਇਸ ਲਈ ਧਿਆਨ ਰੱਖਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ ਕਿ ਇਹਨਾਂ ਇਨਿਹਿਬਟਰਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਦੇ ਬਾਵਜੂਦ ਉਂਗਲਾਂ ਤੋਂ RNases ਨੂੰ ਪੇਸ਼ ਨਾ ਕੀਤਾ ਜਾਵੇ।
ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟਸ ਆਰਐਨਏ ਦੇ ਸੀਡੀਐਨਏ ਵਿੱਚ ਪਰਿਵਰਤਨ ਨੂੰ ਉਤਪ੍ਰੇਰਿਤ ਕਰਦਾ ਹੈ।M-MLV ਅਤੇ AMV ਦੋਵਾਂ ਦੀ ਆਪਣੀ ਪੋਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਗਤੀਵਿਧੀ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ ਐਂਡੋਜੇਨਸ RNaseH ਗਤੀਵਿਧੀ ਹੈ।RNaseH ਗਤੀਵਿਧੀ ਆਰਐਨਏ ਟੈਂਪਲੇਟਾਂ ਅਤੇ ਡੀਐਨਏ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਜਾਂ ਸੀਡੀਐਨਏ ਐਕਸਟੈਂਸ਼ਨ ਸਟ੍ਰੈਂਡਾਂ ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਬਣੇ ਹੇਟਰੋਜ਼ਾਈਗਸ ਸਟ੍ਰੈਂਡਾਂ ਲਈ ਪੋਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਗਤੀਵਿਧੀ ਨਾਲ ਮੁਕਾਬਲਾ ਕਰਦੀ ਹੈ, ਅਤੇ ਡੀਐਨਏ ਕੰਪਲੈਕਸਾਂ ਵਿੱਚ ਆਰਐਨਏ: ਆਰਐਨਏ ਸਟ੍ਰੈਂਡਸ ਨੂੰ ਘਟਾਉਂਦੀ ਹੈ।RNaseH ਗਤੀਵਿਧੀ ਦੁਆਰਾ ਘਟਾਏ ਗਏ ਆਰਐਨਏ ਟੈਂਪਲੇਟਸ ਨੂੰ ਹੁਣ cDNA ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਲਈ ਪ੍ਰਭਾਵੀ ਸਬਸਟਰੇਟਾਂ ਵਜੋਂ ਨਹੀਂ ਵਰਤਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ, cDNA ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਦੀ ਉਪਜ ਅਤੇ ਲੰਬਾਈ ਨੂੰ ਘਟਾਉਂਦਾ ਹੈ।ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟੇਜ ਦੀ RNaseH ਗਤੀਵਿਧੀ ਨੂੰ ਖਤਮ ਕਰਨਾ ਜਾਂ ਬਹੁਤ ਘੱਟ ਕਰਨਾ ਬਹੁਤ ਲਾਭਦਾਇਕ ਹੋਵੇਗਾ।
SuperScriptⅡ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟੇਜ, RNaseH ਦਾ MMLV ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟੇਜ- ਅਤੇ ਥਰਮੋਸਕ੍ਰਿਪਟ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟੇਜ, RNaseH ਦੀ AMV- ਨੇ MMLV ਅਤੇ AMV ਨਾਲੋਂ ਵੱਧ ਪੂਰੀ-ਲੰਬਾਈ ਵਾਲਾ cDNA ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤਾ।RT-PCR ਸੰਵੇਦਨਸ਼ੀਲਤਾ cDNA ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਦੁਆਰਾ ਪ੍ਰਭਾਵਿਤ ਹੁੰਦੀ ਹੈ।ThermoScript AMV ਨਾਲੋਂ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਸੰਵੇਦਨਸ਼ੀਲ ਹੈ।RT-PCR ਉਤਪਾਦਾਂ ਦਾ ਆਕਾਰ ਸੀਡੀਐਨਏ ਨੂੰ ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਕਰਨ ਲਈ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟੇਜ ਦੀ ਯੋਗਤਾ ਦੁਆਰਾ ਸੀਮਿਤ ਹੈ, ਖਾਸ ਕਰਕੇ ਜਦੋਂ ਵੱਡੇ ਸੀਡੀਐਨਏ ਦੀ ਕਲੋਨਿੰਗ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ।MMLV ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ, SuperScripⅡ ਨੇ ਲੰਬੇ RT-PCR ਉਤਪਾਦਾਂ ਦੀ ਪੈਦਾਵਾਰ ਵਿੱਚ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਵਾਧਾ ਕੀਤਾ ਹੈ।RNaseH- ਦਾ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟੇਜ ਵੀ ਥਰਮਲ ਸਥਿਰਤਾ ਨੂੰ ਵਧਾਉਂਦਾ ਹੈ, ਇਸਲਈ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ 37-42℃ ਦੇ ਆਮ ਨਾਲੋਂ ਵੱਧ ਤਾਪਮਾਨਾਂ 'ਤੇ ਕੀਤੀ ਜਾ ਸਕਦੀ ਹੈ।ਸੁਝਾਏ ਗਏ ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਦੀਆਂ ਸਥਿਤੀਆਂ ਦੇ ਤਹਿਤ, ਓਲੀਗੋ (ਡੀਟੀ) ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਅਤੇ 10μCi [ਅਲਫ਼ਾ-ਪੀ] ਡੀਸੀਟੀਪੀ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਪਹਿਲੀ ਚੇਨ ਦੇ ਕੁੱਲ ਉਤਪਾਦਨ ਦੀ ਗਣਨਾ TCA ਵਰਖਾ ਵਿਧੀ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਪੂਰੀ-ਲੰਬਾਈ ਦੇ cDNA ਦਾ ਆਕਾਰ-ਕ੍ਰਮਬੱਧ ਸਟ੍ਰਿਪ ਹਟਾਉਣ ਅਤੇ ਇੱਕ ਅਲਕਲੀਨ ਐਗਰੋਸ ਜੈੱਲ ਵਿੱਚ ਗਿਣਨ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।
3. ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਦੇ ਤਾਪ ਸੰਭਾਲ ਤਾਪਮਾਨ ਨੂੰ ਵਧਾਓ：
ਉੱਚ ਹੋਲਡਿੰਗ ਤਾਪਮਾਨ RNA ਦੀ ਸੈਕੰਡਰੀ ਬਣਤਰ ਨੂੰ ਖੋਲ੍ਹਣ ਅਤੇ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਦੀ ਪੈਦਾਵਾਰ ਨੂੰ ਵਧਾਉਣ ਵਿੱਚ ਮਦਦ ਕਰਦਾ ਹੈ।ਜ਼ਿਆਦਾਤਰ RNA ਟੈਂਪਲੇਟਾਂ ਲਈ, RNA ਅਤੇ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਨੂੰ 65°C 'ਤੇ ਬਫਰ ਜਾਂ ਲੂਣ ਤੋਂ ਬਿਨਾਂ ਰੱਖਣ ਅਤੇ ਫਿਰ ਉਹਨਾਂ ਨੂੰ ਬਰਫ਼ 'ਤੇ ਤੇਜ਼ੀ ਨਾਲ ਠੰਡਾ ਕਰਨ ਨਾਲ ਜ਼ਿਆਦਾਤਰ ਸੈਕੰਡਰੀ ਬਣਤਰਾਂ ਖਤਮ ਹੋ ਜਾਂਦੀਆਂ ਹਨ ਅਤੇ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਨੂੰ ਬੰਨ੍ਹਣ ਦੀ ਇਜਾਜ਼ਤ ਮਿਲਦੀ ਹੈ।ਹਾਲਾਂਕਿ, ਕੁਝ ਟੈਂਪਲੇਟਾਂ ਦੀ ਅਜੇ ਵੀ ਸੈਕੰਡਰੀ ਬਣਤਰ ਹੁੰਦੀ ਹੈ, ਭਾਵੇਂ ਕਿ ਥਰਮਲ ਵਿਕਾਰ ਦੇ ਬਾਅਦ ਵੀ।ਇਹਨਾਂ ਔਖੇ ਟੈਂਪਲੇਟਾਂ ਦਾ ਵਿਸਤਾਰ ਥਰਮੋਸਕ੍ਰਿਪਟ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟਸ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਅਤੇ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਨੂੰ ਬਿਹਤਰ ਬਣਾਉਣ ਲਈ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟਸ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਨੂੰ ਉੱਚ ਤਾਪਮਾਨਾਂ 'ਤੇ ਰੱਖ ਕੇ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਉੱਚ ਹੋਲਡਿੰਗ ਤਾਪਮਾਨ ਵੀ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਨੂੰ ਵਧਾ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਖਾਸ ਕਰਕੇ ਜਦੋਂ ਜੀਨ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਪ੍ਰਾਈਮਰ (GSPS) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ cDNA ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ (ਅਧਿਆਇ 3 ਦੇਖੋ)।ਜੇਕਰ GSP ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰ ਰਹੇ ਹੋ, ਤਾਂ ਯਕੀਨੀ ਬਣਾਓ ਕਿ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਦਾ Tm ਮੁੱਲ ਸੰਭਾਵਿਤ ਹੋਲਡਿੰਗ ਤਾਪਮਾਨ ਦੇ ਸਮਾਨ ਹੈ।ਓਲੀਗੋ(dT) ਅਤੇ 60℃ ਤੋਂ ਉੱਪਰ ਦੇ ਬੇਤਰਤੀਬੇ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਨਾ ਕਰੋ।ਬੇਤਰਤੀਬ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਨੂੰ 60℃ ਤੱਕ ਵਧਾਉਣ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ 10 ਮਿੰਟ ਲਈ 25℃ ਤੇ ਰੱਖਣ ਦੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ।ਉੱਚੇ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਤਾਪਮਾਨਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਨ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਆਰਐਨਏ/ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਮਿਸ਼ਰਣ ਨੂੰ 65℃ ਡੀਨੇਚਰਿੰਗ ਤਾਪਮਾਨ ਤੋਂ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਹੋਲਡਿੰਗ ਤਾਪਮਾਨ ਵਿੱਚ ਸਿੱਧੇ ਟ੍ਰਾਂਸਫਰ ਕਰਕੇ ਅਤੇ ਪ੍ਰੀਹੀਟਿਡ 2× ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਮਿਸ਼ਰਣ (cDNA ਥਰਮਲ ਇਨੀਸ਼ੀਏਸ਼ਨ ਸਿੰਥੇਸਿਸ) ਨੂੰ ਜੋੜ ਕੇ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਨੂੰ ਸੁਧਾਰਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਇਹ ਪਹੁੰਚ ਇੰਟਰਮੋਲੀਕਿਊਲਰ ਬੇਸ ਪੇਅਰਿੰਗ ਨੂੰ ਰੋਕਣ ਵਿੱਚ ਮਦਦ ਕਰਦੀ ਹੈ ਜੋ ਹੇਠਲੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ ਹੁੰਦੀ ਹੈ।ਇੱਕ PCR ਯੰਤਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਨਾ RT-PCR ਲਈ ਲੋੜੀਂਦੇ ਬਹੁਤ ਸਾਰੇ ਤਾਪਮਾਨ ਸਵਿੱਚਾਂ ਨੂੰ ਸਰਲ ਬਣਾਉਂਦਾ ਹੈ।
Tth ਹੀਟ ਸਟੇਬਲਾਈਜ਼ਡ ਪੋਲੀਮੇਰੇਜ਼ Mg2+ ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਵਿੱਚ DNA ਪੋਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਅਤੇ Mn2+ ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਵਿੱਚ RNA ਪੋਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਵਜੋਂ ਕੰਮ ਕਰਦਾ ਹੈ।ਇਹ 65 ℃ ਤੱਕ ਗਰਮੀ ਨੂੰ ਰੋਕ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਹਾਲਾਂਕਿ, PCR ਦੇ ਦੌਰਾਨ Mn2+ ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਵਫ਼ਾਦਾਰੀ ਨੂੰ ਘਟਾਉਂਦੀ ਹੈ, ਜੋ Tth ਪੌਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਨੂੰ ਉੱਚ ਸਟੀਕਸ਼ਨ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ cDNA ਕਲੋਨਿੰਗ ਲਈ ਘੱਟ ਢੁਕਵਾਂ ਬਣਾਉਂਦਾ ਹੈ।ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ 'ਤੇ Tth ਘੱਟ ਕੁਸ਼ਲ ਹੈ, ਜੋ ਸੰਵੇਦਨਸ਼ੀਲਤਾ ਨੂੰ ਘਟਾਉਂਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਕਿਉਂਕਿ ਇੱਕ ਸਿੰਗਲ ਐਂਜ਼ਾਈਮ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਅਤੇ ਪੀਸੀਆਰ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਤੋਂ ਬਿਨਾਂ ਨਿਯੰਤਰਣ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਦੂਸ਼ਿਤ ਜੀਨੋਮਿਕ ਡੀਐਨਏ ਤੋਂ cDNA ਦੇ ਵਧੇ ਹੋਏ ਉਤਪਾਦਾਂ ਨੂੰ ਵੱਖ ਕਰਨ ਲਈ ਨਹੀਂ ਕੀਤੀ ਜਾ ਸਕਦੀ।
4. ਐਡੀਟਿਵ ਜੋ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਨੂੰ ਉਤਸ਼ਾਹਿਤ ਕਰਦਾ ਹੈ:
ਪਹਿਲੀ ਚੇਨ ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਵਿੱਚ ਗਲਾਈਸਰੀਨ ਅਤੇ ਡੀਐਮਐਸਓ ਸਮੇਤ ਐਡਿਟਿਵਜ਼ ਨੂੰ ਜੋੜਨਾ ਨਿਊਕਲੀਕ ਐਸਿਡ ਡਬਲ ਸਟ੍ਰੈਂਡ ਦੀ ਸਥਿਰਤਾ ਨੂੰ ਘਟਾ ਸਕਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਆਰਐਨਏ ਸੈਕੰਡਰੀ ਬਣਤਰ ਨੂੰ ਖੋਲ੍ਹ ਸਕਦਾ ਹੈ।SuperScriptⅡ ਜਾਂ MMLV ਦੀ ਗਤੀਵਿਧੀ ਨੂੰ ਪ੍ਰਭਾਵਿਤ ਕੀਤੇ ਬਿਨਾਂ 20% ਗਲੀਸਰੀਨ ਜਾਂ 10% DMSO ਜੋੜਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।AMV ਗਤੀਵਿਧੀ ਨੂੰ ਘਟਾਏ ਬਿਨਾਂ 20% ਗਲਾਈਸਰੋਲ ਨੂੰ ਵੀ ਬਰਦਾਸ਼ਤ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ।SuperScriptⅡ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਵਿੱਚ RT-PCR ਦੀ ਸੰਵੇਦਨਸ਼ੀਲਤਾ ਨੂੰ ਵੱਧ ਤੋਂ ਵੱਧ ਕਰਨ ਲਈ, 10% ਗਲਾਈਸਰੋਲ ਨੂੰ ਜੋੜਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ ਅਤੇ 45℃ 'ਤੇ ਇੰਸੂਲੇਟ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਜੇ ਰੀਟ੍ਰੋਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ-ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਉਤਪਾਦ ਦਾ 1/10 ਪੀਸੀਆਰ ਵਿੱਚ ਜੋੜਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਤਾਂ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਵਿੱਚ ਗਲਾਈਸਰੋਲ ਦੀ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ 0.4% ਹੈ, ਜੋ ਕਿ ਪੀਸੀਆਰ ਨੂੰ ਰੋਕਣ ਲਈ ਕਾਫ਼ੀ ਨਹੀਂ ਹੈ।
5. RNaseH ਪ੍ਰੋਸੈਸਿੰਗ:
PCR ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ RNaseH ਨਾਲ cDNA ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਦਾ ਇਲਾਜ ਕਰਕੇ ਸੰਵੇਦਨਸ਼ੀਲਤਾ ਨੂੰ ਸੁਧਾਰਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਕੁਝ ਟੈਂਪਲੇਟਾਂ ਲਈ, ਇਹ ਸੋਚਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਸੀਡੀਐਨਏ ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਵਿੱਚ ਆਰਐਨਏ ਐਂਪਲੀਫਾਈਡ ਉਤਪਾਦਾਂ ਦੇ ਬਾਈਡਿੰਗ ਨੂੰ ਰੋਕਦਾ ਹੈ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ RNaseH ਇਲਾਜ ਸੰਵੇਦਨਸ਼ੀਲਤਾ ਨੂੰ ਵਧਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਇੱਕ ਮੁਕਾਬਲਤਨ ਲੰਬੇ ਪੂਰੀ-ਲੰਬਾਈ ਵਾਲੇ cDNA ਟਾਰਗੇਟ ਟੈਂਪਲੇਟ ਨੂੰ ਵਧਾਉਣ ਲਈ RNaseH ਇਲਾਜ ਦੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਟਿਊਬਰਸ ਸਕਰੋਸਿਸⅡ ਘੱਟ ਕਾਪੀ ਦੇ ਨਾਲ।ਇਸ ਔਖੇ ਟੈਂਪਲੇਟ ਲਈ, RNaseH ਨੇ SuperScriptⅡ ਜਾਂ AMV ਦੁਆਰਾ ਸੰਸ਼ਲੇਸ਼ਿਤ cDNA ਦੁਆਰਾ ਤਿਆਰ ਸਿਗਨਲ ਨੂੰ ਵਧਾਇਆ।ਜ਼ਿਆਦਾਤਰ RT-PCR ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਲਈ, RNaseH ਇਲਾਜ ਵਿਕਲਪਿਕ ਹੁੰਦਾ ਹੈ ਕਿਉਂਕਿ 95℃ ਇੰਸੂਲੇਟਿਡ PCR ਡੈਨੇਟੁਰੇਸ਼ਨ ਸਟੈਪ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ RNA ਤੋਂ RNA ਨੂੰ ਹਾਈਡ੍ਰੋਲਾਈਜ਼ ਕਰਦਾ ਹੈ: DNA ਕੰਪਲੈਕਸ।
6. ਆਰਐਨਏ ਦੀ ਛੋਟੀ ਮਾਤਰਾ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾਉਣ ਲਈ ਸੁਧਾਰੇ ਗਏ ਤਰੀਕੇ:
ਆਰਟੀ-ਪੀਸੀਆਰ ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ ਚੁਣੌਤੀਪੂਰਨ ਹੁੰਦਾ ਹੈ ਜਦੋਂ ਸਿਰਫ ਥੋੜ੍ਹੀ ਮਾਤਰਾ ਵਿੱਚ ਆਰਐਨਏ ਉਪਲਬਧ ਹੁੰਦੇ ਹਨ।RNA ਵੱਖ ਹੋਣ ਦੇ ਦੌਰਾਨ ਇੱਕ ਕੈਰੀਅਰ ਵਜੋਂ ਗਲਾਈਕੋਜਨ ਦਾ ਜੋੜ ਛੋਟੇ ਨਮੂਨਿਆਂ ਦੀ ਪੈਦਾਵਾਰ ਨੂੰ ਵਧਾਉਣ ਵਿੱਚ ਮਦਦ ਕਰਦਾ ਹੈ।ਇੱਕ RNase-ਮੁਕਤ ਗਲਾਈਕੋਜਨ ਉਸੇ ਸਮੇਂ ਟ੍ਰਾਈਜ਼ੋਲ ਦੇ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਜੋੜਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਗਲਾਈਕੋਜਨ ਪਾਣੀ ਵਿੱਚ ਘੁਲਣਸ਼ੀਲ ਹੈ ਅਤੇ ਬਾਅਦ ਵਿੱਚ ਵਰਖਾ ਵਿੱਚ ਸਹਾਇਤਾ ਕਰਨ ਲਈ ਆਰਐਨਏ ਨਾਲ ਪਾਣੀ ਦੇ ਪੜਾਅ ਵਿੱਚ ਰਹਿ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਟਿਸ਼ੂ ਜਾਂ 106 ਸੰਸਕ੍ਰਿਤ ਸੈੱਲਾਂ ਦੇ 50mg ਤੋਂ ਘੱਟ ਨਮੂਨਿਆਂ ਲਈ RNase-ਮੁਕਤ ਗਲਾਈਕੋਜਨ ਦੀ ਸਿਫ਼ਾਰਸ਼ ਕੀਤੀ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ 250μg/ml ਹੈ।
SuperScriptⅡ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਪ੍ਰਤੀਲਿਪੀ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਨੂੰ ਉਲਟਾਉਣ ਲਈ ਐਸੀਟਿਲੇਟਡ BSA ਨੂੰ ਜੋੜਨਾ ਸੰਵੇਦਨਸ਼ੀਲਤਾ ਨੂੰ ਵਧਾ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ RNA ਦੀ ਛੋਟੀ ਮਾਤਰਾ ਲਈ, SuperScriptⅡ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਨੂੰ ਘਟਾ ਕੇ ਅਤੇ RnaseOut ਨਿਊਕਲੀਜ਼ ਇਨ੍ਹੀਬੀਟਰ ਦੀਆਂ 40 ਯੂਨਿਟਾਂ ਜੋੜਨ ਨਾਲ ਖੋਜ ਪੱਧਰ ਨੂੰ ਬਿਹਤਰ ਬਣਾਇਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਜੇਕਰ ਗਲਾਈਕੋਜਨ ਦੀ ਵਰਤੋਂ RNA ਵਿਭਾਜਨ ਵਿੱਚ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ, ਤਾਂ SuperScriptⅡ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਪ੍ਰਤੀਲਿਪੀ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਨੂੰ ਉਲਟਾਉਣ ਲਈ BSA ਜਾਂ RNase ਇਨਿਹਿਬਟਰਸ ਨੂੰ ਜੋੜਨ ਦੀ ਅਜੇ ਵੀ ਸਿਫਾਰਸ਼ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ।
Ⅱ. RT-PCR ਦੀ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਵਧਾਓ
1. ਸੀਐਨਡੀਏ ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ:
ਪਹਿਲੇ ਸਟ੍ਰੈਂਡ cDNA ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਨੂੰ ਸ਼ੁਰੂ ਕਰਨ ਲਈ ਤਿੰਨ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਤਰੀਕਿਆਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਜਾ ਸਕਦੀ ਹੈ, ਅਤੇ ਹਰੇਕ ਵਿਧੀ ਦੀ ਸਾਪੇਖਿਕ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਸੰਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਅਤੇ ਕਿਸਮ ਨੂੰ ਪ੍ਰਭਾਵਿਤ ਕਰਦੀ ਹੈ।
ਰੈਂਡਮ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਵਿਧੀ ਤਿੰਨ ਤਰੀਕਿਆਂ ਵਿੱਚੋਂ ਸਭ ਤੋਂ ਘੱਟ ਖਾਸ ਹੈ।ਛੋਟੇ, ਅੰਸ਼ਕ ਲੰਬਾਈ ਵਾਲੇ cDNA ਪੈਦਾ ਕਰਨ ਲਈ ਪੂਰੇ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟ ਵਿੱਚ ਕਈ ਸਾਈਟਾਂ 'ਤੇ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਨੂੰ ਐਨੀਲ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਇਹ ਵਿਧੀ ਅਕਸਰ ਸੈਕੰਡਰੀ ਢਾਂਚਾਗਤ ਖੇਤਰਾਂ ਵਾਲੇ ਆਰਐਨਏ ਟੈਂਪਲੇਟਾਂ ਤੋਂ 5′ ਟਰਮੀਨਲ ਕ੍ਰਮ ਅਤੇ cDNA ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਨ ਲਈ ਵਰਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ ਜਾਂ ਉਹਨਾਂ ਸਾਈਟਾਂ ਨੂੰ ਸਮਾਪਤ ਕਰਨ ਵਾਲੀਆਂ ਸਾਈਟਾਂ ਨਾਲ ਜੋ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟਸ ਨਕਲ ਨਹੀਂ ਕਰ ਸਕਦੀਆਂ।ਸਭ ਤੋਂ ਲੰਬਾ cDNA ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਨ ਲਈ, ਹਰੇਕ RNA ਨਮੂਨੇ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਦੇ RNA ਅਤੇ ਅਨੁਪਾਤ ਨੂੰ ਅਨੁਭਵੀ ਤੌਰ 'ਤੇ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨ ਦੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ।ਬੇਤਰਤੀਬ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਦੀ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਪ੍ਰਤੀ 20μl ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਪ੍ਰਣਾਲੀ 50 ਤੋਂ 250ng ਤੱਕ ਹੁੰਦੀ ਹੈ।ਕਿਉਂਕਿ ਬੇਤਰਤੀਬ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਕੁੱਲ RNA ਤੋਂ ਸੰਸ਼ਲੇਸ਼ਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ cDNA ਮੁੱਖ ਤੌਰ 'ਤੇ ਰਿਬੋਸੋਮਲ RNA ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਪੌਲੀ(A)+RNA ਨੂੰ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਟੈਪਲੇਟ ਵਜੋਂ ਚੁਣਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।
Oligo(dT) ਦੀ ਸ਼ੁਰੂਆਤ ਬੇਤਰਤੀਬ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਨਾਲੋਂ ਵਧੇਰੇ ਖਾਸ ਹੈ।ਇਹ ਜ਼ਿਆਦਾਤਰ ਯੂਕੇਰੀਓਟਿਕ ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ mRNA ਦੇ 3′ ਸਿਰੇ 'ਤੇ ਪਾਈ ਗਈ ਪੌਲੀ(A) ਪੂਛ ਨਾਲ ਹਾਈਬ੍ਰਿਡਾਈਜ਼ ਕਰਦਾ ਹੈ।ਕਿਉਂਕਿ ਪੌਲੀ(A)+RNA ਕੁੱਲ RNA ਦਾ ਲਗਭਗ 1% ਤੋਂ 2% ਹੈ, cDNA ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਅਤੇ ਗੁੰਝਲਤਾ ਉਸ ਨਾਲੋਂ ਬਹੁਤ ਘੱਟ ਹੈ ਜੇਕਰ ਬੇਤਰਤੀਬ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਵਰਤੇ ਗਏ ਸਨ।ਇਸਦੀ ਉੱਚ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਦੇ ਕਾਰਨ, oligo(dT) ਨੂੰ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ RNA ਤੋਂ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਅਨੁਪਾਤ ਅਤੇ ਪੌਲੀ(A)+ ਚੋਣ ਲਈ ਅਨੁਕੂਲਤਾ ਦੀ ਲੋੜ ਨਹੀਂ ਹੁੰਦੀ ਹੈ।0.5μg oligo(dT) ਪ੍ਰਤੀ 20μl ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਪ੍ਰਣਾਲੀ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਨ ਦੀ ਸਿਫਾਰਸ਼ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ।oligo(dT)12-18 ਜ਼ਿਆਦਾਤਰ RT-PCR ਲਈ ਢੁਕਵਾਂ ਹੈ।ThermoScript RT-PCR ਸਿਸਟਮ ਇਸਦੀ ਚੰਗੀ ਥਰਮਲ ਸਥਿਰਤਾ ਦੇ ਕਾਰਨ ਓਲੀਗੋ(dT)20 ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਉੱਚ ਹੋਲਡਿੰਗ ਤਾਪਮਾਨ ਲਈ ਢੁਕਵਾਂ ਹੈ।
ਜੀਨ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਪ੍ਰਾਈਮਰ (GSP) ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਸਟੈਪ ਲਈ ਸਭ ਤੋਂ ਵਧੀਆ ਖਾਸ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਹਨ।GSP ਇੱਕ ਐਂਟੀਸੈਂਸ ਓਲੀਗੋਨਿਊਕਲੀਓਸਾਈਡ ਹੈ ਜੋ ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ RNA ਮੰਜ਼ਿਲ ਕ੍ਰਮਾਂ ਨਾਲ ਹਾਈਬ੍ਰਿਡਾਈਜ਼ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਨਾ ਕਿ ਸਾਰੇ Rnas ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਬੇਤਰਤੀਬ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਜਾਂ ਓਲੀਗੋ(dT) ਨੂੰ ਐਨੀਲ ਕਰਨ ਦੀ ਬਜਾਏ।PCR ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਨੂੰ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਕਰਨ ਲਈ ਵਰਤੇ ਗਏ ਨਿਯਮ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ GSP ਦੇ ਡਿਜ਼ਾਈਨ 'ਤੇ ਵੀ ਲਾਗੂ ਹੁੰਦੇ ਹਨ।GSP ਉਹੀ ਕ੍ਰਮ ਹੋ ਸਕਦਾ ਹੈ ਜਿਵੇਂ ਕਿ mRNA3′ ਦੇ ਅੰਤ ਵਿੱਚ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਐਨੀਲਡ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਜਾਂ GSP ਨੂੰ ਰਿਵਰਸ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਦੇ ਨਾਲ ਹੇਠਾਂ ਵੱਲ ਐਨੀਲਡ ਕਰਨ ਲਈ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਕੁਝ ਵਿਸਤ੍ਰਿਤ ਵਸਤੂਆਂ ਲਈ, ਸਫਲ RT-PCR ਲਈ ਇੱਕ ਤੋਂ ਵੱਧ ਐਂਟੀਸੈਂਸ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਕਰਨੇ ਜ਼ਰੂਰੀ ਹਨ ਕਿਉਂਕਿ ਨਿਸ਼ਾਨਾ RNA ਦੀ ਸੈਕੰਡਰੀ ਬਣਤਰ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਨੂੰ ਬਾਈਡਿੰਗ ਤੋਂ ਰੋਕ ਸਕਦੀ ਹੈ।20μl ਦੀ ਪਹਿਲੀ ਚੇਨ ਸਿੰਥੇਸਿਸ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਪ੍ਰਣਾਲੀ ਵਿੱਚ 1pmol ਐਂਟੀਸੈਂਸ GSP ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਨ ਦਾ ਸੁਝਾਅ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਹੈ।
2. ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਦੇ ਤਾਪ ਸੰਭਾਲ ਤਾਪਮਾਨ ਨੂੰ ਵਧਾਓ：
ਜੀਐਸਪੀ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਦਾ ਪੂਰਾ ਲਾਭ ਲੈਣ ਲਈ, ਉੱਚ ਥਰਮਲ ਸਥਿਰਤਾ ਦੇ ਨਾਲ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟਸ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਜਾਣੀ ਚਾਹੀਦੀ ਹੈ।ਤਾਪ-ਸਥਿਰ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟਸ ਨੂੰ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਦੀ ਕਠੋਰਤਾ ਵਧਾਉਣ ਲਈ ਉੱਚ ਤਾਪਮਾਨਾਂ 'ਤੇ ਇੰਸੂਲੇਟ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਉਦਾਹਰਨ ਲਈ, ਜੇਕਰ ਇੱਕ GSP ਨੂੰ 55°C 'ਤੇ ਐਨੀਲ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਤਾਂ GSP ਦੀ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਪੂਰੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਨਹੀਂ ਵਰਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ ਜੇਕਰ ਉਲਟਾ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ 37°C 'ਤੇ AMV ਜਾਂ M-MLV ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਘੱਟ ਕਠੋਰਤਾ ਨਾਲ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਹਾਲਾਂਕਿ, SuperScripⅡ ਅਤੇ ThermoScript 50℃ ਜਾਂ ਵੱਧ 'ਤੇ ਪ੍ਰਤੀਕਿਰਿਆ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹਨ, ਜੋ ਘੱਟ ਤਾਪਮਾਨਾਂ 'ਤੇ ਪੈਦਾ ਕੀਤੇ ਗੈਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਉਤਪਾਦਾਂ ਨੂੰ ਖਤਮ ਕਰ ਦਿੰਦਾ ਹੈ।ਵੱਧ ਤੋਂ ਵੱਧ ਵਿਸ਼ਿਸ਼ਟਤਾ ਲਈ, RNA/ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਮਿਸ਼ਰਣ ਨੂੰ 65℃ ਡੈਨੇਚਰੇਸ਼ਨ ਤਾਪਮਾਨ ਤੋਂ ਸਿੱਧਾ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਹੋਲਡਿੰਗ ਤਾਪਮਾਨ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰੀਹੀਟਿਡ 2 x ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਮਿਸ਼ਰਣ (cDNA ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਦੀ ਥਰਮਲ ਸ਼ੁਰੂਆਤ) ਦੇ ਨਾਲ ਟ੍ਰਾਂਸਫਰ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਇਹ ਘੱਟ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ ਅਣੂਆਂ ਵਿਚਕਾਰ ਬੇਸ ਪੇਅਰਿੰਗ ਨੂੰ ਰੋਕਣ ਵਿੱਚ ਮਦਦ ਕਰਦਾ ਹੈ।ਇੱਕ PCR ਯੰਤਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਨਾ RT-PCR ਲਈ ਲੋੜੀਂਦੇ ਬਹੁਤ ਸਾਰੇ ਤਾਪਮਾਨ ਪਰਿਵਰਤਨ ਨੂੰ ਸਰਲ ਬਣਾਉਂਦਾ ਹੈ।
3. ਜੀਨੋਮਿਕ ਡੀਐਨਏ ਗੰਦਗੀ ਨੂੰ ਘਟਾਓ:
RT-PCR ਨਾਲ ਇੱਕ ਸੰਭਾਵੀ ਮੁਸ਼ਕਲ ਇਹ ਹੈ ਕਿ RNA ਜੀਨੋਮਿਕ DNA ਨੂੰ ਦੂਸ਼ਿਤ ਕਰਦਾ ਹੈ।ਬਿਹਤਰ ਆਰਐਨਏ ਵੱਖ ਕਰਨ ਦੇ ਤਰੀਕਿਆਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਟ੍ਰਾਈਜ਼ੋਲ ਰੀਏਜੈਂਟ, ਆਰਐਨਏ ਦੀਆਂ ਤਿਆਰੀਆਂ ਵਿੱਚ ਜੀਨੋਮਿਕ ਡੀਐਨਏ ਗੰਦਗੀ ਨੂੰ ਘਟਾਉਂਦੀ ਹੈ।ਜੀਨੋਮਿਕ ਡੀਐਨਏ ਤੋਂ ਪੈਦਾ ਹੋਏ ਉਤਪਾਦਾਂ ਤੋਂ ਬਚਣ ਲਈ, ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ ਦੂਸ਼ਿਤ ਡੀਐਨਏ ਨੂੰ ਹਟਾਉਣ ਲਈ ਆਰਐਨਏ ਦਾ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਗ੍ਰੇਡ DnasⅠ ਨਾਲ ਇਲਾਜ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਨਮੂਨਿਆਂ ਨੂੰ DNaseⅠ ਪਾਚਨ ਨੂੰ ਖਤਮ ਕਰਨ ਲਈ 10 ਮਿੰਟ ਲਈ 2.0mM EDTA ਵਿੱਚ 65℃ 'ਤੇ ਰੱਖਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।EDTA ਉੱਚ ਤਾਪਮਾਨਾਂ 'ਤੇ ਹੋਣ ਵਾਲੇ ਮੈਗਨੀਸ਼ੀਅਮ ਆਇਨ ਨਿਰਭਰ ਆਰਐਨਏ ਹਾਈਡੋਲਿਸਿਸ ਨੂੰ ਰੋਕਣ ਲਈ ਮੈਗਨੀਸ਼ੀਅਮ ਆਇਨਾਂ ਨੂੰ ਚੇਲੇਟ ਕਰਦਾ ਹੈ।
ਜੀਨੋਮ ਡੀਐਨਏ ਐਂਪਲੀਫੀਕੇਸ਼ਨ ਉਤਪਾਦ ਤੋਂ ਐਂਪਲੀਫਾਈਡ ਸੀਡੀਐਨਏ ਨੂੰ ਵੱਖ ਕਰਨ ਲਈ, ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਜੋ ਵੱਖਰੇ ਕੀਤੇ ਐਕਸੋਨ ਨਾਲ ਵੱਖਰੇ ਤੌਰ 'ਤੇ ਐਨੀਲ ਕਰਦੇ ਹਨ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਕੀਤੇ ਜਾ ਸਕਦੇ ਹਨ।ਸੀਡੀਐਨਏ ਤੋਂ ਲਏ ਗਏ ਪੀਸੀਆਰ ਉਤਪਾਦ ਦੂਸ਼ਿਤ ਜੀਨੋਮਿਕ ਡੀਐਨਏ ਤੋਂ ਲਏ ਗਏ ਉਤਪਾਦਾਂ ਨਾਲੋਂ ਛੋਟੇ ਹੋਣਗੇ।ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਤੋਂ ਬਿਨਾਂ ਇੱਕ ਨਿਯੰਤਰਿਤ ਪ੍ਰਯੋਗ ਹਰੇਕ RNA ਟੈਂਪਲੇਟ 'ਤੇ ਇਹ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨ ਲਈ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਕੀ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਟੁਕੜਾ ਜੀਨੋਮਿਕ DNA ਜਾਂ cDNA ਤੋਂ ਹੈ।ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਦੀ ਅਣਹੋਂਦ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੇ ਪੀਸੀਆਰ ਉਤਪਾਦ ਜੀਨੋਮ ਤੋਂ ਲਏ ਗਏ ਹਨ।
ਸੰਬੰਧਿਤ ਉਤਪਾਦ
-ਵਨ-ਸਟੈਪ ਕਿੱਟ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਅਤੇ ਪੀਸੀਆਰ ਨੂੰ ਇੱਕੋ ਟਿਊਬ ਵਿੱਚ ਕੀਤੇ ਜਾਣ ਦੇ ਯੋਗ ਬਣਾਉਂਦੀ ਹੈ।ਇਸ ਨੂੰ ਸਿਰਫ਼ ਟੈਂਪਲੇਟ RNA, ਖਾਸ PCR ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਅਤੇ RNase-ਮੁਕਤ ddH ਜੋੜਨ ਦੀ ਲੋੜ ਹੈ2O.
-ਆਰਐਨਏ ਦਾ ਰੀਅਲ-ਟਾਈਮ ਮਾਤਰਾਤਮਕ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਤੇਜ਼ੀ ਨਾਲ ਅਤੇ ਸਹੀ ਢੰਗ ਨਾਲ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।
-ਕਿੱਟ ਇੱਕ ਵਿਲੱਖਣ ਫੋਰਜੀਨ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਰੀਏਜੈਂਟ ਅਤੇ ਫੋਰਜੀਨ ਹੌਟਸਟਾਰ ਟਾਕ ਡੀਐਨਏ ਪੋਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੀ ਹੈ ਜੋ ਇੱਕ ਵਿਲੱਖਣ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਪ੍ਰਣਾਲੀ ਦੇ ਨਾਲ ਮਿਲਾ ਕੇ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਦੀ ਵਿਸਤ੍ਰਿਤ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਅਤੇ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਵਿੱਚ ਸੁਧਾਰ ਕਰਦੀ ਹੈ।
- ਅਨੁਕੂਲਿਤ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਪ੍ਰਣਾਲੀ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਨੂੰ ਉੱਚ ਖੋਜ ਸੰਵੇਦਨਸ਼ੀਲਤਾ, ਮਜ਼ਬੂਤ ਥਰਮਲ ਸਥਿਰਤਾ, ਅਤੇ ਬਿਹਤਰ ਸਹਿਣਸ਼ੀਲਤਾ ਬਣਾਉਂਦਾ ਹੈ।
-ਜੀਡੀਐਨਏ ਨੂੰ ਹਟਾਉਣ ਦੀ ਕੁਸ਼ਲ ਯੋਗਤਾ, ਜੋ 2 ਮਿੰਟਾਂ ਦੇ ਅੰਦਰ ਟੈਂਪਲੇਟ ਵਿੱਚ ਜੀਡੀਐਨਏ ਨੂੰ ਹਟਾ ਸਕਦੀ ਹੈ।
-ਕੁਸ਼ਲ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਸਿਸਟਮ, ਪਹਿਲੇ ਸਟ੍ਰੈਂਡ cDNA ਦੇ ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਨੂੰ ਪੂਰਾ ਕਰਨ ਵਿੱਚ ਸਿਰਫ 15 ਮਿੰਟ ਲੱਗਦੇ ਹਨ।
-ਕੰਪਲੈਕਸ ਟੈਂਪਲੇਟਸ: ਉੱਚ GC ਸਮੱਗਰੀ ਅਤੇ ਗੁੰਝਲਦਾਰ ਸੈਕੰਡਰੀ ਢਾਂਚੇ ਵਾਲੇ ਟੈਂਪਲੇਟਸ ਨੂੰ ਵੀ ਉੱਚ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਨਾਲ ਉਲਟਾਇਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।
-ਉੱਚ-ਸੰਵੇਦਨਸ਼ੀਲਤਾ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਸਿਸਟਮ, ਪੀਜੀ-ਪੱਧਰ ਦੇ ਟੈਂਪਲੇਟਸ ਵੀ ਉੱਚ-ਗੁਣਵੱਤਾ ਵਾਲੇ ਸੀਡੀਐਨਏ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹਨ।
-ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਸਿਸਟਮ ਵਿੱਚ ਉੱਚ ਥਰਮਲ ਸਥਿਰਤਾ ਹੈ, ਅਨੁਕੂਲ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਦਾ ਤਾਪਮਾਨ 42 ℃ ਹੈ, ਅਤੇ ਇਸ ਵਿੱਚ ਅਜੇ ਵੀ 50 ℃ ਤੇ ਵਧੀਆ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਨ ਹੈ।
ਪੋਸਟ ਟਾਈਮ: ਮਾਰਚ-07-2023
