1. ਮੁਢਲਾ ਗਿਆਨ (ਜੇ ਤੁਸੀਂ ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਭਾਗ ਦੇਖਣਾ ਚਾਹੁੰਦੇ ਹੋ, ਤਾਂ ਕਿਰਪਾ ਕਰਕੇ ਸਿੱਧੇ ਦੂਜੇ ਭਾਗ ਵਿੱਚ ਟ੍ਰਾਂਸਫਰ ਕਰੋ)
ਪਰੰਪਰਾਗਤ ਪੀਸੀਆਰ ਦੀ ਇੱਕ ਡੈਰੀਵੇਟਿਵ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਦੇ ਰੂਪ ਵਿੱਚ, ਰੀਅਲ ਟਾਈਮ ਪੀਸੀਆਰ ਮੁੱਖ ਤੌਰ 'ਤੇ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਸਿਗਨਲ ਦੇ ਬਦਲਾਵ ਦੁਆਰਾ ਪੀਸੀਆਰ ਐਂਪਲੀਫੀਕੇਸ਼ਨ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਦੇ ਹਰੇਕ ਚੱਕਰ ਵਿੱਚ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਉਤਪਾਦ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਵਿੱਚ ਤਬਦੀਲੀ ਦੀ ਨਿਗਰਾਨੀ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਸੀਟੀ ਮੁੱਲ ਅਤੇ ਸਟੈਂਡਰਡ ਕਰਵ ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਸਬੰਧ ਦੁਆਰਾ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਟੈਂਪਲੇਟ ਦਾ ਗਿਣਾਤਮਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕਰਦਾ ਹੈ।
RT-PCR ਦੇ ਖਾਸ ਡੇਟਾ ਹਨਬੇਸਲਾਈਨ, ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਥ੍ਰੈਸ਼ਹੋਲਡਅਤੇਸੀਟੀ ਮੁੱਲ।
ਬੇਸਲਾਈਨ: | 3rd-15 ਵੇਂ ਚੱਕਰ ਦਾ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਮੁੱਲ ਬੇਸਲਾਈਨ (ਬੇਸਲਾਈਨ) ਹੈ, ਜੋ ਕਿ ਮਾਪ ਦੀ ਕਦੇ-ਕਦਾਈਂ ਗਲਤੀ ਕਾਰਨ ਹੁੰਦਾ ਹੈ। |
ਥ੍ਰੈਸ਼ਹੋਲਡ (ਥ੍ਰੈਸ਼ਹੋਲਡ): | ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਕਰਵ ਦੇ ਘਾਤਕ ਵਿਕਾਸ ਖੇਤਰ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਢੁਕਵੀਂ ਸਥਿਤੀ 'ਤੇ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤੀ ਫਲੋਰਸੈਂਸ ਖੋਜ ਸੀਮਾ ਦਾ ਹਵਾਲਾ ਦਿੰਦਾ ਹੈ, ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਬੇਸਲਾਈਨ ਦੇ ਮਿਆਰੀ ਵਿਵਹਾਰ ਤੋਂ 10 ਗੁਣਾ। |
CT ਮੁੱਲ: | ਇਹ ਪੀਸੀਆਰ ਚੱਕਰਾਂ ਦੀ ਸੰਖਿਆ ਹੁੰਦੀ ਹੈ ਜਦੋਂ ਹਰੇਕ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਟਿਊਬ ਵਿੱਚ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਮੁੱਲ ਥ੍ਰੈਸ਼ਹੋਲਡ ਤੱਕ ਪਹੁੰਚਦਾ ਹੈ। Ct ਮੁੱਲ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਟੈਂਪਲੇਟ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਦੇ ਉਲਟ ਅਨੁਪਾਤੀ ਹੈ। |
RT-PCR ਲਈ ਲੇਬਲਿੰਗ ਦੇ ਆਮ ਤਰੀਕੇ:
ਢੰਗ | ਫਾਇਦਾ | ਕਮੀ | ਐਪਲੀਕੇਸ਼ਨ ਦਾ ਦਾਇਰਾ |
SYBR ਹਰਾⅠ | ਵਿਆਪਕ ਲਾਗੂ, ਸੰਵੇਦਨਸ਼ੀਲ, ਸਸਤੀ ਅਤੇ ਸੁਵਿਧਾਜਨਕ | ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਦੀਆਂ ਲੋੜਾਂ ਉੱਚੀਆਂ ਹਨ, ਗੈਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਬੈਂਡਾਂ ਦੀ ਸੰਭਾਵਨਾ ਹੈ | ਇਹ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਟੀਚੇ ਵਾਲੇ ਜੀਨਾਂ ਦੇ ਗਿਣਾਤਮਕ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ, ਜੀਨ ਸਮੀਕਰਨ 'ਤੇ ਖੋਜ, ਅਤੇ ਟ੍ਰਾਂਸਜੇਨਿਕ ਰੀਕੰਬੀਨੈਂਟ ਜਾਨਵਰਾਂ ਅਤੇ ਪੌਦਿਆਂ 'ਤੇ ਖੋਜ ਲਈ ਢੁਕਵਾਂ ਹੈ। |
ਤਾਕਮਾਨ | ਚੰਗੀ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਅਤੇ ਉੱਚ ਦੁਹਰਾਉਣਯੋਗਤਾ | ਕੀਮਤ ਉੱਚ ਹੈ ਅਤੇ ਸਿਰਫ਼ ਖਾਸ ਟੀਚਿਆਂ ਲਈ ਢੁਕਵੀਂ ਹੈ। | ਜਰਾਸੀਮ ਦੀ ਖੋਜ, ਡਰੱਗ ਪ੍ਰਤੀਰੋਧ ਜੀਨ ਖੋਜ, ਡਰੱਗ ਪ੍ਰਭਾਵੀਤਾ ਮੁਲਾਂਕਣ, ਜੈਨੇਟਿਕ ਰੋਗਾਂ ਦਾ ਨਿਦਾਨ। |
ਅਣੂ ਬੀਕਨ | ਉੱਚ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ, ਫਲੋਰਸੈਂਸ, ਘੱਟ ਪਿਛੋਕੜ | ਕੀਮਤ ਉੱਚ ਹੈ, ਇਹ ਸਿਰਫ਼ ਇੱਕ ਖਾਸ ਮਕਸਦ ਲਈ ਢੁਕਵਾਂ ਹੈ, ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਮੁਸ਼ਕਲ ਹੈ, ਅਤੇ ਕੀਮਤ ਉੱਚ ਹੈ. | ਖਾਸ ਜੀਨ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ, SNP ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ |
2. ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਕਦਮ
2.1 ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਸਮੂਹ ਬਾਰੇ- ਸਮੂਹ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਤੋਂ ਵੱਧ ਖੂਹ ਹੋਣੇ ਚਾਹੀਦੇ ਹਨ, ਅਤੇ ਜੀਵ-ਵਿਗਿਆਨਕ ਦੁਹਰਾਓ ਹੋਣੇ ਚਾਹੀਦੇ ਹਨ।
① | ਖਾਲੀ ਕੰਟਰੋਲ | ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਵਿੱਚ ਸੈੱਲ ਵਿਕਾਸ ਸਥਿਤੀ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾਉਣ ਲਈ ਵਰਤਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ |
② | ਨੈਗੇਟਿਵ ਕੰਟਰੋਲ siRNA (ਗੈਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ siRNA ਕ੍ਰਮ) | RNAi ਕਿਰਿਆ ਦੀ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਦਾ ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਨ ਕਰੋ।siRNA 200nM ਦੀ ਇਕਾਗਰਤਾ 'ਤੇ ਗੈਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਤਣਾਅ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਨੂੰ ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ। |
③ | ਟ੍ਰਾਂਸਫੈਕਸ਼ਨ ਰੀਐਜੈਂਟ ਕੰਟਰੋਲ | ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਟ੍ਰਾਂਸਫੈਕਸ਼ਨ ਰੀਏਜੈਂਟ ਦੀ ਜ਼ਹਿਰੀਲੇਪਣ ਜਾਂ ਟੀਚੇ ਵਾਲੇ ਜੀਨ ਦੇ ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ 'ਤੇ ਪ੍ਰਭਾਵ ਨੂੰ ਬਾਹਰ ਕੱਢੋ |
④ | ਨਿਸ਼ਾਨਾ ਜੀਨ ਦੇ ਵਿਰੁੱਧ siRNA | ਟੀਚੇ ਦੇ ਜੀਨ ਦੇ ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਨੂੰ ਹੇਠਾਂ ਸੁੱਟੋ |
⑤ (ਵਿਕਲਪਿਕ) | ਸਕਾਰਾਤਮਕ siRNA | ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਪ੍ਰਣਾਲੀ ਅਤੇ ਸੰਚਾਲਨ ਸੰਬੰਧੀ ਸਮੱਸਿਆਵਾਂ ਦੇ ਨਿਪਟਾਰੇ ਲਈ ਵਰਤਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ |
⑥ (ਵਿਕਲਪਿਕ) | ਫਲੋਰਸੈਂਟ ਕੰਟਰੋਲ siRNA | ਸੈੱਲ ਟ੍ਰਾਂਸਫੈਕਸ਼ਨ ਦੀ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਨੂੰ ਮਾਈਕ੍ਰੋਸਕੋਪ ਨਾਲ ਦੇਖਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ |
2.2 ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਦੇ ਸਿਧਾਂਤ
ਵਿਸਤ੍ਰਿਤ ਟੁਕੜੇ ਦਾ ਆਕਾਰ | ਤਰਜੀਹੀ ਤੌਰ 'ਤੇ 100-150bp |
ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਦੀ ਲੰਬਾਈ | 18-25 ਬੀ.ਪੀ |
GC ਸਮੱਗਰੀ | 30%-70%, ਤਰਜੀਹੀ ਤੌਰ 'ਤੇ 45%-55% |
Tm ਮੁੱਲ | 58-60℃ |
ਕ੍ਰਮ | ਲਗਾਤਾਰ T/C ਬਚੋ;A/G ਨਿਰੰਤਰ |
੩ਅੰਤ ਕ੍ਰਮ | GC ਅਮੀਰ ਜਾਂ AT ਅਮੀਰਾਂ ਤੋਂ ਬਚੋ;ਟਰਮੀਨਲ ਬੇਸ ਤਰਜੀਹੀ ਤੌਰ 'ਤੇ G ਜਾਂ C ਹੈ;ਟੀ ਤੋਂ ਬਚਣਾ ਸਭ ਤੋਂ ਵਧੀਆ ਹੈ |
ਪੂਰਕਤਾ | ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਦੇ ਅੰਦਰ ਜਾਂ ਦੋ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ 3 ਤੋਂ ਵੱਧ ਬੇਸਾਂ ਦੇ ਪੂਰਕ ਕ੍ਰਮ ਤੋਂ ਬਚੋ |
ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ | ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਦੀ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕਰਨ ਲਈ ਧਮਾਕੇ ਦੀ ਖੋਜ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ |
①SiRNA ਸਪੀਸੀਜ਼-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਹੈ, ਅਤੇ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਪ੍ਰਜਾਤੀਆਂ ਦੇ ਕ੍ਰਮ ਵੱਖਰੇ ਹੋਣਗੇ।
②SiRNA ਨੂੰ ਫ੍ਰੀਜ਼-ਸੁੱਕੇ ਪਾਊਡਰ ਵਿੱਚ ਪੈਕ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਜਿਸ ਨੂੰ ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ 2-4 ਹਫ਼ਤਿਆਂ ਲਈ ਸਥਿਰਤਾ ਨਾਲ ਸਟੋਰ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।
2.3 ਟੂਲ ਜਾਂ ਰੀਐਜੈਂਟ ਜਿਨ੍ਹਾਂ ਨੂੰ ਪਹਿਲਾਂ ਤੋਂ ਤਿਆਰ ਕਰਨ ਦੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ
ਪ੍ਰਾਈਮਰ (ਅੰਦਰੂਨੀ ਹਵਾਲਾ) | ਅੱਗੇ ਅਤੇ ਉਲਟਾ ਦੋ ਸਮੇਤ |
ਪ੍ਰਾਈਮਰ (ਟਾਰਗੇਟ ਜੀਨ) | ਅੱਗੇ ਅਤੇ ਉਲਟਾ ਦੋ ਸਮੇਤ |
ਟਾਰਗੇਟ ਸੀ ਆਰ ਐਨ ਏ (3 ਪੱਟੀਆਂ) | ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਕੰਪਨੀ 3 ਸਟ੍ਰਿਪਾਂ ਦਾ ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਕਰੇਗੀ, ਅਤੇ ਫਿਰ RT-PCR ਦੁਆਰਾ ਤਿੰਨਾਂ ਵਿੱਚੋਂ ਇੱਕ ਦੀ ਚੋਣ ਕਰੇਗੀ। |
ਟ੍ਰਾਂਸਫੈਕਸ਼ਨ ਕਿੱਟ | ਲਿਪੋ 2000 ਆਦਿ |
ਆਰਐਨਏ ਰੈਪਿਡ ਐਕਸਟਰੈਕਸ਼ਨ ਕਿੱਟ | ਟ੍ਰਾਂਸਫੈਕਸ਼ਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਆਰਐਨਏ ਕੱਢਣ ਲਈ |
ਰੈਪਿਡ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਕਿੱਟ | cDNA ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਲਈ |
ਪੀਸੀਆਰ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਕਿੱਟ | 2×ਸੁਪਰ SYBR ਗ੍ਰੀਨ qPCR ਮਾਸਟਰ ਮਿਕਸ |
2.4 ਖਾਸ ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਕਦਮਾਂ ਵਿੱਚ ਉਹਨਾਂ ਮੁੱਦਿਆਂ ਦੇ ਸੰਬੰਧ ਵਿੱਚ ਜਿਨ੍ਹਾਂ ਵੱਲ ਧਿਆਨ ਦੇਣ ਦੀ ਲੋੜ ਹੈ:
①siRNA ਟ੍ਰਾਂਸਫੈਕਸ਼ਨ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ
1. ਪਲੇਟ ਲਗਾਉਣ ਲਈ, ਤੁਸੀਂ 24-ਵੈਲ ਪਲੇਟ, 12-ਵੈਲ ਪਲੇਟ ਜਾਂ 6-ਵੈਲ ਪਲੇਟ ਚੁਣ ਸਕਦੇ ਹੋ (24-ਵੈਲ ਪਲੇਟ ਦੇ ਹਰੇਕ ਖੂਹ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਸਤਾਵਿਤ ਔਸਤ RNA ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਲਗਭਗ 100-300 ng/uL ਹੈ), ਅਤੇ ਸੈੱਲਾਂ ਦੀ ਸਰਵੋਤਮ ਟ੍ਰਾਂਸਫੈਕਸ਼ਨ ਘਣਤਾ 60% -80% ਤੱਕ ਹੈ।
2. ਟ੍ਰਾਂਸਫੈਕਸ਼ਨ ਦੇ ਕਦਮ ਅਤੇ ਖਾਸ ਲੋੜਾਂ ਸਖਤੀ ਨਾਲ ਨਿਰਦੇਸ਼ਾਂ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ ਹਨ।
3. ਟ੍ਰਾਂਸਫੈਕਸ਼ਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, mRNA ਖੋਜ (RT-PCR) ਜਾਂ 48-96 ਘੰਟਿਆਂ (WB) ਦੇ ਅੰਦਰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਖੋਜ ਲਈ ਨਮੂਨੇ 24-72 ਘੰਟਿਆਂ ਦੇ ਅੰਦਰ ਇਕੱਠੇ ਕੀਤੇ ਜਾ ਸਕਦੇ ਹਨ।
② RNA ਕੱਢਣ ਦੀ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ
1. exogenous ਐਨਜ਼ਾਈਮ ਦੁਆਰਾ ਗੰਦਗੀ ਨੂੰ ਰੋਕਣ.ਇਸ ਵਿੱਚ ਮੁੱਖ ਤੌਰ 'ਤੇ ਮਾਸਕ ਅਤੇ ਦਸਤਾਨਿਆਂ ਨੂੰ ਸਖਤੀ ਨਾਲ ਪਹਿਨਣਾ ਸ਼ਾਮਲ ਹੈ;ਨਿਰਜੀਵ ਪਾਈਪੇਟ ਟਿਪਸ ਅਤੇ EP ਟਿਊਬਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਨਾ;ਪ੍ਰਯੋਗ ਵਿੱਚ ਵਰਤਿਆ ਗਿਆ ਪਾਣੀ RNase-ਮੁਕਤ ਹੋਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ।
2. ਤੇਜ਼ ਐਕਸਟਰੈਕਸ਼ਨ ਕਿੱਟ ਵਿੱਚ ਸੁਝਾਏ ਅਨੁਸਾਰ ਦੋ ਵਾਰ ਕਰਨ ਦੀ ਸਿਫਾਰਸ਼ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ, ਜੋ ਅਸਲ ਵਿੱਚ ਸ਼ੁੱਧਤਾ ਅਤੇ ਉਪਜ ਵਿੱਚ ਸੁਧਾਰ ਕਰੇਗਾ।
3. ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਦਾ ਤਰਲ RNA ਕਾਲਮ ਨੂੰ ਨਹੀਂ ਛੂਹਣਾ ਚਾਹੀਦਾ।
③ RNA ਮਾਪਣਾ
ਆਰਐਨਏ ਨੂੰ ਕੱਢੇ ਜਾਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਇਸਨੂੰ ਨੈਨੋਡ੍ਰੌਪ ਨਾਲ ਸਿੱਧੇ ਤੌਰ 'ਤੇ ਮਾਪਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਘੱਟੋ-ਘੱਟ ਰੀਡਿੰਗ 10ng/ul ਤੱਕ ਘੱਟ ਹੋ ਸਕਦੀ ਹੈ।
④ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ
1. RT-qPCR ਦੀ ਉੱਚ ਸੰਵੇਦਨਸ਼ੀਲਤਾ ਦੇ ਕਾਰਨ, ਹਰੇਕ ਨਮੂਨੇ ਲਈ ਘੱਟੋ-ਘੱਟ 3 ਸਮਾਨਾਂਤਰ ਖੂਹ ਬਣਾਏ ਜਾਣੇ ਚਾਹੀਦੇ ਹਨ ਤਾਂ ਜੋ ਬਾਅਦ ਵਾਲੇ Ct ਨੂੰ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਵੱਖਰੇ ਹੋਣ ਜਾਂ SD ਨੂੰ ਅੰਕੜਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਲਈ ਬਹੁਤ ਵੱਡਾ ਹੋਣ ਤੋਂ ਰੋਕਿਆ ਜਾ ਸਕੇ।
2. ਮਾਸਟਰ ਮਿਕਸ ਨੂੰ ਵਾਰ-ਵਾਰ ਫ੍ਰੀਜ਼ ਅਤੇ ਪਿਘਲਾਓ ਨਾ।
3. ਹਰੇਕ ਟਿਊਬ/ਮੋਰੀ ਨੂੰ ਇੱਕ ਨਵੀਂ ਟਿਪ ਨਾਲ ਬਦਲਿਆ ਜਾਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ!ਨਮੂਨੇ ਜੋੜਨ ਲਈ ਲਗਾਤਾਰ ਇੱਕੋ ਪਾਈਪੇਟ ਟਿਪ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਨਾ ਕਰੋ!
4. ਨਮੂਨਾ ਜੋੜਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ 96-ਖੂਹ ਵਾਲੀ ਪਲੇਟ ਨਾਲ ਜੁੜੀ ਫਿਲਮ ਨੂੰ ਇੱਕ ਪਲੇਟ ਨਾਲ ਸਮਤਲ ਕਰਨ ਦੀ ਲੋੜ ਹੈ।ਇਸ ਨੂੰ ਮਸ਼ੀਨ 'ਤੇ ਲਗਾਉਣ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਜ ਕਰਨਾ ਸਭ ਤੋਂ ਵਧੀਆ ਹੈ, ਤਾਂ ਜੋ ਟਿਊਬ ਦੀ ਕੰਧ 'ਤੇ ਤਰਲ ਹੇਠਾਂ ਵਹਿ ਸਕੇ ਅਤੇ ਹਵਾ ਦੇ ਬੁਲਬੁਲੇ ਨੂੰ ਹਟਾ ਸਕੇ।
⑤ਆਮ ਕਰਵ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ
ਲਘੂਗਣਕ ਵਿਕਾਸ ਦੀ ਕੋਈ ਮਿਆਦ ਨਹੀਂ | ਟੈਂਪਲੇਟ ਦੀ ਸੰਭਾਵਤ ਤੌਰ 'ਤੇ ਉੱਚ ਤਵੱਜੋ |
ਕੋਈ CT ਮੁੱਲ ਨਹੀਂ | ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਸਿਗਨਲਾਂ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾਉਣ ਲਈ ਗਲਤ ਕਦਮ; ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਜਾਂ ਪੜਤਾਲਾਂ ਦੀ ਗਿਰਾਵਟ - ਇਸਦੀ ਇਕਸਾਰਤਾ PAGE ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਫੋਰੇਸਿਸ ਦੁਆਰਾ ਖੋਜੀ ਜਾ ਸਕਦੀ ਹੈ; ਟੈਂਪਲੇਟ ਦੀ ਨਾਕਾਫ਼ੀ ਮਾਤਰਾ; ਟੈਂਪਲੇਟਸ ਦੀ ਗਿਰਾਵਟ - ਨਮੂਨੇ ਦੀ ਤਿਆਰੀ ਵਿੱਚ ਅਸ਼ੁੱਧੀਆਂ ਦੀ ਸ਼ੁਰੂਆਤ ਅਤੇ ਵਾਰ-ਵਾਰ ਜੰਮਣ ਅਤੇ ਪਿਘਲਣ ਤੋਂ ਬਚਣਾ; |
ਸੀਟੀ> 38 | ਘੱਟ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਕੁਸ਼ਲਤਾ;ਪੀਸੀਆਰ ਉਤਪਾਦ ਬਹੁਤ ਲੰਮਾ ਹੈ;ਵੱਖ-ਵੱਖ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਦੇ ਹਿੱਸੇ ਘਟਾਏ ਜਾਂਦੇ ਹਨ |
ਲੀਨੀਅਰ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਕਰਵ | ਬਾਰ-ਬਾਰ ਫ੍ਰੀਜ਼-ਥੌ ਚੱਕਰਾਂ ਜਾਂ ਰੌਸ਼ਨੀ ਦੇ ਲੰਬੇ ਸਮੇਂ ਤੱਕ ਸੰਪਰਕ ਨਾਲ ਪੜਤਾਲਾਂ ਨੂੰ ਅੰਸ਼ਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਘਟਾਇਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ |
ਡੁਪਲੀਕੇਟ ਛੇਕ ਵਿੱਚ ਅੰਤਰ ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ ਵੱਡਾ ਹੈ | ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਦਾ ਹੱਲ ਪੂਰੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਪਿਘਲਿਆ ਨਹੀਂ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਜਾਂ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਦਾ ਹੱਲ ਮਿਲਾਇਆ ਨਹੀਂ ਜਾਂਦਾ ਹੈ;ਪੀਸੀਆਰ ਯੰਤਰ ਦਾ ਥਰਮਲ ਇਸ਼ਨਾਨ ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਪਦਾਰਥਾਂ ਦੁਆਰਾ ਦੂਸ਼ਿਤ ਹੁੰਦਾ ਹੈ |
2.5 ਡਾਟਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਬਾਰੇ
qPCR ਦੇ ਡੇਟਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੂੰ ਸਾਪੇਖਿਕ ਮਾਤਰਾ ਅਤੇ ਸੰਪੂਰਨ ਮਾਤਰਾ ਵਿੱਚ ਵੰਡਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਉਦਾਹਰਨ ਲਈ, ਨਿਯੰਤਰਣ ਸਮੂਹ ਵਿੱਚ ਸੈੱਲਾਂ ਦੀ ਤੁਲਨਾ ਵਿੱਚ ਇਲਾਜ ਸਮੂਹ ਵਿੱਚ ਸੈੱਲ,
X ਜੀਨ ਦਾ mRNA ਕਿੰਨੀ ਵਾਰ ਬਦਲਦਾ ਹੈ, ਇਹ ਸਾਪੇਖਿਕ ਮਾਤਰਾ ਹੈ;ਸੈੱਲਾਂ ਦੀ ਇੱਕ ਨਿਸ਼ਚਿਤ ਗਿਣਤੀ ਵਿੱਚ, X ਜੀਨ ਦਾ mRNA
ਕਿੰਨੀਆਂ ਕਾਪੀਆਂ ਹਨ, ਇਹ ਪੂਰਨ ਮਾਤਰਾ ਹੈ।ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਜੋ ਅਸੀਂ ਪ੍ਰਯੋਗਸ਼ਾਲਾ ਵਿੱਚ ਸਭ ਤੋਂ ਵੱਧ ਵਰਤਦੇ ਹਾਂ ਉਹ ਹੈ ਅਨੁਸਾਰੀ ਮਾਤਰਾਤਮਕ ਵਿਧੀ।ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ,2-ΔΔct ਵਿਧੀਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਵਿੱਚ ਸਭ ਤੋਂ ਵੱਧ ਵਰਤਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਇਸ ਲਈ ਇੱਥੇ ਸਿਰਫ਼ ਇਸ ਵਿਧੀ ਨੂੰ ਵਿਸਥਾਰ ਵਿੱਚ ਪੇਸ਼ ਕੀਤਾ ਜਾਵੇਗਾ।
2-ΔΔct ਵਿਧੀ: ਪ੍ਰਾਪਤ ਨਤੀਜਾ ਨਿਯੰਤਰਣ ਸਮੂਹ ਵਿੱਚ ਟੀਚਾ ਜੀਨ ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਸਮੂਹ ਵਿੱਚ ਟੀਚਾ ਜੀਨ ਦੇ ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਵਿੱਚ ਅੰਤਰ ਹੈ।ਇਹ ਲੋੜੀਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਟੀਚੇ ਵਾਲੇ ਜੀਨ ਅਤੇ ਅੰਦਰੂਨੀ ਸੰਦਰਭ ਜੀਨ ਦੋਵਾਂ ਦੀ ਵਿਸਤ੍ਰਿਤ ਕੁਸ਼ਲਤਾਵਾਂ 100% ਦੇ ਨੇੜੇ ਹੋਣ, ਅਤੇ ਸੰਬੰਧਿਤ ਵਿਵਹਾਰ 5% ਤੋਂ ਵੱਧ ਨਹੀਂ ਹੋਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ।
ਗਣਨਾ ਵਿਧੀ ਹੇਠ ਲਿਖੇ ਅਨੁਸਾਰ ਹੈ:
Δct ਨਿਯੰਤਰਣ ਸਮੂਹ = ਨਿਯੰਤਰਣ ਸਮੂਹ ਵਿੱਚ ਟੀਚਾ ਜੀਨ ਦਾ ct ਮੁੱਲ - ਨਿਯੰਤਰਣ ਸਮੂਹ ਵਿੱਚ ਅੰਦਰੂਨੀ ਸੰਦਰਭ ਜੀਨ ਦਾ ct ਮੁੱਲ
Δct ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਸਮੂਹ = ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਸਮੂਹ ਵਿੱਚ ਟੀਚਾ ਜੀਨ ਦਾ ct ਮੁੱਲ - ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਸਮੂਹ ਵਿੱਚ ਅੰਦਰੂਨੀ ਸੰਦਰਭ ਜੀਨ ਦਾ ct ਮੁੱਲ
ΔΔct=Δct ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਸਮੂਹ-Δct ਕੰਟਰੋਲ ਗਰੁੱਪ
ਅੰਤ ਵਿੱਚ, ਸਮੀਕਰਨ ਪੱਧਰ ਵਿੱਚ ਅੰਤਰ ਦੇ ਗੁਣਜ ਦੀ ਗਣਨਾ ਕਰੋ:
ਫੋਲਡ ਬਦਲੋ = 2-ΔΔct (ਐਕਸਲ ਫੰਕਸ਼ਨ ਨਾਲ ਸੰਬੰਧਿਤ ਪਾਵਰ ਹੈ)
ਸੰਬੰਧਿਤ ਉਤਪਾਦ:
ਪੋਸਟ ਟਾਈਮ: ਮਈ-20-2023