1. ਮੁਢਲਾ ਗਿਆਨ (ਜੇ ਤੁਸੀਂ ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਭਾਗ ਦੇਖਣਾ ਚਾਹੁੰਦੇ ਹੋ, ਤਾਂ ਕਿਰਪਾ ਕਰਕੇ ਸਿੱਧੇ ਦੂਜੇ ਭਾਗ ਵਿੱਚ ਟ੍ਰਾਂਸਫਰ ਕਰੋ)

ਪਰੰਪਰਾਗਤ ਪੀਸੀਆਰ ਦੀ ਇੱਕ ਡੈਰੀਵੇਟਿਵ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਦੇ ਰੂਪ ਵਿੱਚ, ਰੀਅਲ ਟਾਈਮ ਪੀਸੀਆਰ ਮੁੱਖ ਤੌਰ 'ਤੇ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਸਿਗਨਲ ਦੇ ਬਦਲਾਵ ਦੁਆਰਾ ਪੀਸੀਆਰ ਐਂਪਲੀਫੀਕੇਸ਼ਨ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਦੇ ਹਰੇਕ ਚੱਕਰ ਵਿੱਚ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਉਤਪਾਦ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਵਿੱਚ ਤਬਦੀਲੀ ਦੀ ਨਿਗਰਾਨੀ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਸੀਟੀ ਮੁੱਲ ਅਤੇ ਸਟੈਂਡਰਡ ਕਰਵ ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਸਬੰਧ ਦੁਆਰਾ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਟੈਂਪਲੇਟ ਦਾ ਗਿਣਾਤਮਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕਰਦਾ ਹੈ।

RT-PCR ਦੇ ਖਾਸ ਡੇਟਾ ਹਨਬੇਸਲਾਈਨ, ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਥ੍ਰੈਸ਼ਹੋਲਡਅਤੇਸੀਟੀ ਮੁੱਲ।

RT-PCR ਲਈ ਲੇਬਲਿੰਗ ਦੇ ਆਮ ਤਰੀਕੇ:

2. ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਕਦਮ

2.1 ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਸਮੂਹ ਬਾਰੇ- ਸਮੂਹ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਤੋਂ ਵੱਧ ਖੂਹ ਹੋਣੇ ਚਾਹੀਦੇ ਹਨ, ਅਤੇ ਜੀਵ-ਵਿਗਿਆਨਕ ਦੁਹਰਾਓ ਹੋਣੇ ਚਾਹੀਦੇ ਹਨ।

2.2 ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਦੇ ਸਿਧਾਂਤ

①SiRNA ਸਪੀਸੀਜ਼-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਹੈ, ਅਤੇ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਪ੍ਰਜਾਤੀਆਂ ਦੇ ਕ੍ਰਮ ਵੱਖਰੇ ਹੋਣਗੇ।

②SiRNA ਨੂੰ ਫ੍ਰੀਜ਼-ਸੁੱਕੇ ਪਾਊਡਰ ਵਿੱਚ ਪੈਕ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਜਿਸ ਨੂੰ ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ 2-4 ਹਫ਼ਤਿਆਂ ਲਈ ਸਥਿਰਤਾ ਨਾਲ ਸਟੋਰ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।

2.3 ਟੂਲ ਜਾਂ ਰੀਐਜੈਂਟ ਜਿਨ੍ਹਾਂ ਨੂੰ ਪਹਿਲਾਂ ਤੋਂ ਤਿਆਰ ਕਰਨ ਦੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ

2.4 ਖਾਸ ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਕਦਮਾਂ ਵਿੱਚ ਉਹਨਾਂ ਮੁੱਦਿਆਂ ਦੇ ਸੰਬੰਧ ਵਿੱਚ ਜਿਨ੍ਹਾਂ ਵੱਲ ਧਿਆਨ ਦੇਣ ਦੀ ਲੋੜ ਹੈ:

①siRNA ਟ੍ਰਾਂਸਫੈਕਸ਼ਨ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ

1. ਪਲੇਟ ਲਗਾਉਣ ਲਈ, ਤੁਸੀਂ 24-ਵੈਲ ਪਲੇਟ, 12-ਵੈਲ ਪਲੇਟ ਜਾਂ 6-ਵੈਲ ਪਲੇਟ ਚੁਣ ਸਕਦੇ ਹੋ (24-ਵੈਲ ਪਲੇਟ ਦੇ ਹਰੇਕ ਖੂਹ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਸਤਾਵਿਤ ਔਸਤ RNA ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਲਗਭਗ 100-300 ng/uL ਹੈ), ਅਤੇ ਸੈੱਲਾਂ ਦੀ ਸਰਵੋਤਮ ਟ੍ਰਾਂਸਫੈਕਸ਼ਨ ਘਣਤਾ 60% -80% ਤੱਕ ਹੈ।

2. ਟ੍ਰਾਂਸਫੈਕਸ਼ਨ ਦੇ ਕਦਮ ਅਤੇ ਖਾਸ ਲੋੜਾਂ ਸਖਤੀ ਨਾਲ ਨਿਰਦੇਸ਼ਾਂ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ ਹਨ।

3. ਟ੍ਰਾਂਸਫੈਕਸ਼ਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, mRNA ਖੋਜ (RT-PCR) ਜਾਂ 48-96 ਘੰਟਿਆਂ (WB) ਦੇ ਅੰਦਰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਖੋਜ ਲਈ ਨਮੂਨੇ 24-72 ਘੰਟਿਆਂ ਦੇ ਅੰਦਰ ਇਕੱਠੇ ਕੀਤੇ ਜਾ ਸਕਦੇ ਹਨ।

② RNA ਕੱਢਣ ਦੀ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ

1. exogenous ਐਨਜ਼ਾਈਮ ਦੁਆਰਾ ਗੰਦਗੀ ਨੂੰ ਰੋਕਣ.ਇਸ ਵਿੱਚ ਮੁੱਖ ਤੌਰ 'ਤੇ ਮਾਸਕ ਅਤੇ ਦਸਤਾਨਿਆਂ ਨੂੰ ਸਖਤੀ ਨਾਲ ਪਹਿਨਣਾ ਸ਼ਾਮਲ ਹੈ;ਨਿਰਜੀਵ ਪਾਈਪੇਟ ਟਿਪਸ ਅਤੇ EP ਟਿਊਬਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਨਾ;ਪ੍ਰਯੋਗ ਵਿੱਚ ਵਰਤਿਆ ਗਿਆ ਪਾਣੀ RNase-ਮੁਕਤ ਹੋਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ।

2. ਤੇਜ਼ ਐਕਸਟਰੈਕਸ਼ਨ ਕਿੱਟ ਵਿੱਚ ਸੁਝਾਏ ਅਨੁਸਾਰ ਦੋ ਵਾਰ ਕਰਨ ਦੀ ਸਿਫਾਰਸ਼ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ, ਜੋ ਅਸਲ ਵਿੱਚ ਸ਼ੁੱਧਤਾ ਅਤੇ ਉਪਜ ਵਿੱਚ ਸੁਧਾਰ ਕਰੇਗਾ।

3. ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਦਾ ਤਰਲ RNA ਕਾਲਮ ਨੂੰ ਨਹੀਂ ਛੂਹਣਾ ਚਾਹੀਦਾ।

③ RNA ਮਾਪਣਾ

ਆਰਐਨਏ ਨੂੰ ਕੱਢੇ ਜਾਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਇਸਨੂੰ ਨੈਨੋਡ੍ਰੌਪ ਨਾਲ ਸਿੱਧੇ ਤੌਰ 'ਤੇ ਮਾਪਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਘੱਟੋ-ਘੱਟ ਰੀਡਿੰਗ 10ng/ul ਤੱਕ ਘੱਟ ਹੋ ਸਕਦੀ ਹੈ।

④ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ

1. RT-qPCR ਦੀ ਉੱਚ ਸੰਵੇਦਨਸ਼ੀਲਤਾ ਦੇ ਕਾਰਨ, ਹਰੇਕ ਨਮੂਨੇ ਲਈ ਘੱਟੋ-ਘੱਟ 3 ਸਮਾਨਾਂਤਰ ਖੂਹ ਬਣਾਏ ਜਾਣੇ ਚਾਹੀਦੇ ਹਨ ਤਾਂ ਜੋ ਬਾਅਦ ਵਾਲੇ Ct ਨੂੰ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਵੱਖਰੇ ਹੋਣ ਜਾਂ SD ਨੂੰ ਅੰਕੜਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਲਈ ਬਹੁਤ ਵੱਡਾ ਹੋਣ ਤੋਂ ਰੋਕਿਆ ਜਾ ਸਕੇ।

2. ਮਾਸਟਰ ਮਿਕਸ ਨੂੰ ਵਾਰ-ਵਾਰ ਫ੍ਰੀਜ਼ ਅਤੇ ਪਿਘਲਾਓ ਨਾ।

3. ਹਰੇਕ ਟਿਊਬ/ਮੋਰੀ ਨੂੰ ਇੱਕ ਨਵੀਂ ਟਿਪ ਨਾਲ ਬਦਲਿਆ ਜਾਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ!ਨਮੂਨੇ ਜੋੜਨ ਲਈ ਲਗਾਤਾਰ ਇੱਕੋ ਪਾਈਪੇਟ ਟਿਪ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਨਾ ਕਰੋ!

4. ਨਮੂਨਾ ਜੋੜਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ 96-ਖੂਹ ਵਾਲੀ ਪਲੇਟ ਨਾਲ ਜੁੜੀ ਫਿਲਮ ਨੂੰ ਇੱਕ ਪਲੇਟ ਨਾਲ ਸਮਤਲ ਕਰਨ ਦੀ ਲੋੜ ਹੈ।ਇਸ ਨੂੰ ਮਸ਼ੀਨ 'ਤੇ ਲਗਾਉਣ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਜ ਕਰਨਾ ਸਭ ਤੋਂ ਵਧੀਆ ਹੈ, ਤਾਂ ਜੋ ਟਿਊਬ ਦੀ ਕੰਧ 'ਤੇ ਤਰਲ ਹੇਠਾਂ ਵਹਿ ਸਕੇ ਅਤੇ ਹਵਾ ਦੇ ਬੁਲਬੁਲੇ ਨੂੰ ਹਟਾ ਸਕੇ।

⑤ਆਮ ਕਰਵ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ

2.5 ਡਾਟਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਬਾਰੇ

qPCR ਦੇ ਡੇਟਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੂੰ ਸਾਪੇਖਿਕ ਮਾਤਰਾ ਅਤੇ ਸੰਪੂਰਨ ਮਾਤਰਾ ਵਿੱਚ ਵੰਡਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਉਦਾਹਰਨ ਲਈ, ਨਿਯੰਤਰਣ ਸਮੂਹ ਵਿੱਚ ਸੈੱਲਾਂ ਦੀ ਤੁਲਨਾ ਵਿੱਚ ਇਲਾਜ ਸਮੂਹ ਵਿੱਚ ਸੈੱਲ,

X ਜੀਨ ਦਾ mRNA ਕਿੰਨੀ ਵਾਰ ਬਦਲਦਾ ਹੈ, ਇਹ ਸਾਪੇਖਿਕ ਮਾਤਰਾ ਹੈ;ਸੈੱਲਾਂ ਦੀ ਇੱਕ ਨਿਸ਼ਚਿਤ ਗਿਣਤੀ ਵਿੱਚ, X ਜੀਨ ਦਾ mRNA

ਕਿੰਨੀਆਂ ਕਾਪੀਆਂ ਹਨ, ਇਹ ਪੂਰਨ ਮਾਤਰਾ ਹੈ।ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਜੋ ਅਸੀਂ ਪ੍ਰਯੋਗਸ਼ਾਲਾ ਵਿੱਚ ਸਭ ਤੋਂ ਵੱਧ ਵਰਤਦੇ ਹਾਂ ਉਹ ਹੈ ਅਨੁਸਾਰੀ ਮਾਤਰਾਤਮਕ ਵਿਧੀ।ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ,2-ΔΔct ਵਿਧੀਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਵਿੱਚ ਸਭ ਤੋਂ ਵੱਧ ਵਰਤਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਇਸ ਲਈ ਇੱਥੇ ਸਿਰਫ਼ ਇਸ ਵਿਧੀ ਨੂੰ ਵਿਸਥਾਰ ਵਿੱਚ ਪੇਸ਼ ਕੀਤਾ ਜਾਵੇਗਾ।

2-ΔΔct ਵਿਧੀ: ਪ੍ਰਾਪਤ ਨਤੀਜਾ ਨਿਯੰਤਰਣ ਸਮੂਹ ਵਿੱਚ ਟੀਚਾ ਜੀਨ ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਸਮੂਹ ਵਿੱਚ ਟੀਚਾ ਜੀਨ ਦੇ ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਵਿੱਚ ਅੰਤਰ ਹੈ।ਇਹ ਲੋੜੀਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਟੀਚੇ ਵਾਲੇ ਜੀਨ ਅਤੇ ਅੰਦਰੂਨੀ ਸੰਦਰਭ ਜੀਨ ਦੋਵਾਂ ਦੀ ਵਿਸਤ੍ਰਿਤ ਕੁਸ਼ਲਤਾਵਾਂ 100% ਦੇ ਨੇੜੇ ਹੋਣ, ਅਤੇ ਸੰਬੰਧਿਤ ਵਿਵਹਾਰ 5% ਤੋਂ ਵੱਧ ਨਹੀਂ ਹੋਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ।

ਗਣਨਾ ਵਿਧੀ ਹੇਠ ਲਿਖੇ ਅਨੁਸਾਰ ਹੈ:

Δct ਨਿਯੰਤਰਣ ਸਮੂਹ = ਨਿਯੰਤਰਣ ਸਮੂਹ ਵਿੱਚ ਟੀਚਾ ਜੀਨ ਦਾ ct ਮੁੱਲ - ਨਿਯੰਤਰਣ ਸਮੂਹ ਵਿੱਚ ਅੰਦਰੂਨੀ ਸੰਦਰਭ ਜੀਨ ਦਾ ct ਮੁੱਲ

Δct ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਸਮੂਹ = ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਸਮੂਹ ਵਿੱਚ ਟੀਚਾ ਜੀਨ ਦਾ ct ਮੁੱਲ - ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਸਮੂਹ ਵਿੱਚ ਅੰਦਰੂਨੀ ਸੰਦਰਭ ਜੀਨ ਦਾ ct ਮੁੱਲ

ΔΔct=Δct ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਸਮੂਹ-Δct ਕੰਟਰੋਲ ਗਰੁੱਪ

ਅੰਤ ਵਿੱਚ, ਸਮੀਕਰਨ ਪੱਧਰ ਵਿੱਚ ਅੰਤਰ ਦੇ ਗੁਣਜ ਦੀ ਗਣਨਾ ਕਰੋ:

ਫੋਲਡ ਬਦਲੋ = 2-ΔΔct (ਐਕਸਲ ਫੰਕਸ਼ਨ ਨਾਲ ਸੰਬੰਧਿਤ ਪਾਵਰ ਹੈ)

ਸੰਬੰਧਿਤ ਉਤਪਾਦ:

ਸੈੱਲ ਡਾਇਰੈਕਟ RT-qPCR ਕਿੱਟ