• ਪੀਸੀਆਰ ਇੱਕ ਵਿਧੀ ਹੈ ਜੋ ਡੀਐਨਏ ਟੈਂਪਲੇਟ ਦੀ ਇੱਕ ਛੋਟੀ ਜਿਹੀ ਮਾਤਰਾ ਤੋਂ ਡੀਐਨਏ ਨੂੰ ਵਧਾਉਣ ਲਈ ਵਰਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ।RT-PCR ਇੱਕ RNA ਸਰੋਤ ਤੋਂ ਇੱਕ DNA ਟੈਂਪਲੇਟ ਤਿਆਰ ਕਰਨ ਲਈ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦਾ ਹੈ ਜਿਸਨੂੰ ਫਿਰ ਵਧਾਇਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।
• ਪੀਸੀਆਰ ਅਤੇ ਆਰਟੀ-ਪੀਸੀਆਰ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਅੰਤਮ ਬਿੰਦੂ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਹਨ, ਜਦੋਂ ਕਿ qPCR ਅਤੇ RT-qPCR ਮੌਜੂਦ ਟੈਂਪਲੇਟ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਨੂੰ ਮਾਪਣ ਲਈ ਪੀਸੀਆਰ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਦੌਰਾਨ ਉਤਪਾਦ ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਦੀ ਦਰ ਦੇ ਗਤੀ ਵਿਗਿਆਨ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹਨ।
• ਨਵੇਂ ਤਰੀਕੇ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਡਿਜੀਟਲ ਪੀਸੀਆਰ, ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਡੀਐਨਏ ਟੈਂਪਲੇਟ ਦੀ ਪੂਰਨ ਮਾਤਰਾ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰਦੇ ਹਨ, ਜਦੋਂ ਕਿ ਆਈਸੋਥਰਮਲ ਪੀਸੀਆਰ ਵਰਗੇ ਢੰਗ ਭਰੋਸੇਯੋਗ ਨਤੀਜੇ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰਨ ਲਈ ਮਹਿੰਗੇ ਉਪਕਰਣਾਂ ਦੀ ਲੋੜ ਨੂੰ ਘਟਾਉਂਦੇ ਹਨ।

ਪੋਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਚੇਨ ਰਿਐਕਸ਼ਨ (ਪੀਸੀਆਰ) ਡੀਐਨਏ ਅਤੇ ਆਰਐਨਏ ਕ੍ਰਮ ਨੂੰ ਵਧਾਉਣ ਅਤੇ ਖੋਜਣ ਲਈ ਇੱਕ ਮੁਕਾਬਲਤਨ ਸਧਾਰਨ ਅਤੇ ਵਿਆਪਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਵਰਤੀ ਜਾਣ ਵਾਲੀ ਅਣੂ ਜੀਵ ਵਿਗਿਆਨ ਤਕਨੀਕ ਹੈ।ਡੀਐਨਏ ਕਲੋਨਿੰਗ ਅਤੇ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਦੇ ਰਵਾਇਤੀ ਤਰੀਕਿਆਂ ਦੀ ਤੁਲਨਾ ਵਿੱਚ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਅਕਸਰ ਦਿਨ ਲੱਗ ਸਕਦੇ ਹਨ, ਪੀਸੀਆਰ ਨੂੰ ਸਿਰਫ ਕੁਝ ਘੰਟਿਆਂ ਦੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ।PCR ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਸੰਵੇਦਨਸ਼ੀਲ ਹੈ ਅਤੇ ਖਾਸ ਕ੍ਰਮਾਂ ਦੀ ਖੋਜ ਅਤੇ ਪ੍ਰਸਾਰਣ ਲਈ ਘੱਟੋ-ਘੱਟ ਟੈਂਪਲੇਟ ਦੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ।ਬੁਨਿਆਦੀ ਪੀਸੀਆਰ ਵਿਧੀਆਂ ਸਧਾਰਨ ਡੀਐਨਏ ਅਤੇ ਆਰਐਨਏ ਖੋਜ ਤੋਂ ਅੱਗੇ ਵਧੀਆਂ ਹਨ।ਹੇਠਾਂ, ਅਸੀਂ ਤੁਹਾਡੀਆਂ ਖੋਜ ਲੋੜਾਂ ਲਈ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਪੀਸੀਆਰ ਤਰੀਕਿਆਂ ਅਤੇ ਐਂਜ਼ੋ ਲਾਈਫ ਸਾਇੰਸਿਜ਼ ਵਿਖੇ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕੀਤੇ ਗਏ ਰੀਐਜੈਂਟਾਂ ਦੀ ਸੰਖੇਪ ਜਾਣਕਾਰੀ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕੀਤੀ ਹੈ।ਸਾਡਾ ਉਦੇਸ਼ ਵਿਗਿਆਨੀਆਂ ਨੂੰ ਉਹਨਾਂ ਦੇ ਅਗਲੇ ਖੋਜ ਪ੍ਰੋਜੈਕਟ ਵਿੱਚ ਵਰਤਣ ਲਈ ਪੀਸੀਆਰ ਰੀਐਜੈਂਟਸ ਤੱਕ ਜਲਦੀ ਪਹੁੰਚ ਕਰਨ ਵਿੱਚ ਮਦਦ ਕਰਨਾ ਹੈ!

ਪੀ.ਸੀ.ਆਰ

ਸਟੈਂਡਰਡ ਪੀਸੀਆਰ ਲਈ, ਤੁਹਾਨੂੰ ਸਿਰਫ਼ ਇੱਕ ਡੀਐਨਏ ਪੌਲੀਮੇਰੇਜ਼, ਮੈਗਨੀਸ਼ੀਅਮ, ਨਿਊਕਲੀਓਟਾਈਡਸ, ਪ੍ਰਾਈਮਰ, ਡੀਐਨਏ ਟੈਂਪਲੇਟ ਨੂੰ ਵਧਾਉਣ ਲਈ, ਅਤੇ ਇੱਕ ਥਰਮੋਸਾਈਕਲਰ ਦੀ ਲੋੜ ਹੈ।ਪੀਸੀਆਰ ਮਕੈਨਿਜ਼ਮ ਇਸਦੇ ਉਦੇਸ਼ ਦੇ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਸਰਲ ਹੈ: 1) ਡਬਲ-ਸਟ੍ਰੈਂਡਡ ਡੀਐਨਏ (ਡੀਐਸਡੀਐਨਏ) ਹੀਟ ਡੈਨੇਚਰਡ ਹੈ, 2) ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਸਿੰਗਲ ਡੀਐਨਏ ਸਟ੍ਰੈਂਡਾਂ ਨਾਲ ਅਲਾਈਨ ਹੁੰਦੇ ਹਨ, ਅਤੇ 3) ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਨੂੰ ਡੀਐਨਏ ਪੋਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਦੁਆਰਾ ਵਧਾਇਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਦੋ ਕਾਪੀਆਂ ਹੁੰਦੀਆਂ ਹਨ। ਅਸਲੀ DNA ਸਟ੍ਰੈਂਡ।ਤਾਪਮਾਨਾਂ ਅਤੇ ਸਮਿਆਂ ਦੀ ਇੱਕ ਲੜੀ ਵਿੱਚ ਵਿਨਾਸ਼ਕਾਰੀ, ਐਨੀਲਿੰਗ, ਅਤੇ ਲੰਬਾਈ ਦੀ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਨੂੰ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਦੇ ਇੱਕ ਚੱਕਰ (ਚਿੱਤਰ 1) ਵਜੋਂ ਜਾਣਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।

ਚੱਕਰ ਦੇ ਹਰ ਪੜਾਅ ਨੂੰ ਵਰਤੇ ਗਏ ਟੈਂਪਲੇਟ ਅਤੇ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਸੈੱਟ ਲਈ ਅਨੁਕੂਲਿਤ ਕੀਤਾ ਜਾਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ।ਇਹ ਚੱਕਰ ਲਗਭਗ 20-40 ਵਾਰ ਦੁਹਰਾਇਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਫਿਰ ਵਧੇ ਹੋਏ ਉਤਪਾਦ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ ਐਗਰੋਜ਼ ਜੈੱਲ (ਚਿੱਤਰ 2) ਦੁਆਰਾ।

ਕਿਉਂਕਿ ਪੀਸੀਆਰ ਇੱਕ ਬਹੁਤ ਹੀ ਸੰਵੇਦਨਸ਼ੀਲ ਢੰਗ ਹੈ ਅਤੇ ਇੱਕਲੇ ਪ੍ਰਤੀਕਰਮਾਂ ਲਈ ਬਹੁਤ ਘੱਟ ਮਾਤਰਾਵਾਂ ਦੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ, ਕਈ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਲਈ ਇੱਕ ਮਾਸਟਰ ਮਿਸ਼ਰਣ ਤਿਆਰ ਕਰਨ ਦੀ ਸਿਫਾਰਸ਼ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ।ਮਾਸਟਰ ਮਿਸ਼ਰਣ ਨੂੰ ਚੰਗੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਮਿਲਾਇਆ ਜਾਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਫਿਰ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਦੀ ਸੰਖਿਆ ਦੁਆਰਾ ਵੰਡਿਆ ਜਾਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ, ਇਹ ਯਕੀਨੀ ਬਣਾਉਣ ਲਈ ਕਿ ਹਰੇਕ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਵਿੱਚ ਐਨਜ਼ਾਈਮ, dNTP, ਅਤੇ ਪ੍ਰਾਈਮਰਸ ਦੀ ਸਮਾਨ ਮਾਤਰਾ ਹੋਵੇਗੀ।ਬਹੁਤ ਸਾਰੇ ਸਪਲਾਇਰ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ Enzo Life Sciences, PCR ਮਿਕਸ ਵੀ ਪੇਸ਼ ਕਰਦੇ ਹਨ ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਅਤੇ DNA ਟੈਂਪਲੇਟ ਨੂੰ ਛੱਡ ਕੇ ਪਹਿਲਾਂ ਹੀ ਸਭ ਕੁਝ ਸ਼ਾਮਲ ਹੁੰਦਾ ਹੈ।

Guanine/Cytosine-rich (GC-ਅਮੀਰ) ਖੇਤਰ ਮਿਆਰੀ PCR ਤਕਨੀਕਾਂ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਚੁਣੌਤੀ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ।GC-ਅਮੀਰ ਕ੍ਰਮ ਘੱਟ GC ਸਮੱਗਰੀ ਵਾਲੇ ਕ੍ਰਮਾਂ ਨਾਲੋਂ ਵਧੇਰੇ ਸਥਿਰ ਹੁੰਦੇ ਹਨ।ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, GC-ਅਮੀਰ ਕ੍ਰਮ ਸੈਕੰਡਰੀ ਬਣਤਰ ਬਣਾਉਂਦੇ ਹਨ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਹੇਅਰਪਿਨ ਲੂਪਸ।ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ, ਜੀਸੀ-ਅਮੀਰ ਡਬਲ ਸਟ੍ਰੈਂਡਾਂ ਨੂੰ ਵਿਨਾਸ਼ਕਾਰੀ ਪੜਾਅ ਦੌਰਾਨ ਪੂਰੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਵੱਖ ਕਰਨਾ ਮੁਸ਼ਕਲ ਹੁੰਦਾ ਹੈ।ਸਿੱਟੇ ਵਜੋਂ, ਡੀਐਨਏ ਪੋਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਬਿਨਾਂ ਕਿਸੇ ਰੁਕਾਵਟ ਦੇ ਨਵੇਂ ਸਟ੍ਰੈਂਡ ਨੂੰ ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਨਹੀਂ ਕਰ ਸਕਦਾ।ਇੱਕ ਉੱਚ ਡੀਨੈਚੁਰੇਸ਼ਨ ਤਾਪਮਾਨ ਇਸ ਵਿੱਚ ਸੁਧਾਰ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਇੱਕ ਉੱਚ ਐਨੀਲਿੰਗ ਤਾਪਮਾਨ ਅਤੇ ਛੋਟੇ ਐਨੀਲਿੰਗ ਸਮੇਂ ਲਈ ਐਡਜਸਟਮੈਂਟ GC-ਅਮੀਰ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਦੀ ਅਨਿਸ਼ਚਿਤ ਬਾਈਡਿੰਗ ਨੂੰ ਰੋਕ ਸਕਦੇ ਹਨ।ਵਾਧੂ ਰੀਐਜੈਂਟਸ GC-ਅਮੀਰ ਕ੍ਰਮਾਂ ਦੇ ਪ੍ਰਸਾਰ ਨੂੰ ਵਧਾ ਸਕਦੇ ਹਨ।DMSO, glycerol, ਅਤੇ betaine GC ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਦੇ ਕਾਰਨ ਹੋਣ ਵਾਲੇ ਸੈਕੰਡਰੀ ਢਾਂਚੇ ਨੂੰ ਵਿਗਾੜਨ ਵਿੱਚ ਮਦਦ ਕਰਦੇ ਹਨ ਅਤੇ ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ ਡਬਲ ਸਟ੍ਰੈਂਡਾਂ ਨੂੰ ਵੱਖ ਕਰਨ ਦੀ ਸਹੂਲਤ ਦਿੰਦੇ ਹਨ।

ਹੌਟ ਸਟਾਰਟ ਪੀ.ਸੀ.ਆਰ

ਅਸਪਸ਼ਟ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਇੱਕ ਸਮੱਸਿਆ ਹੈ ਜੋ ਪੀਸੀਆਰ ਦੇ ਦੌਰਾਨ ਹੋ ਸਕਦੀ ਹੈ।ਜ਼ਿਆਦਾਤਰ ਡੀਐਨਏ ਪੋਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਜੋ ਪੀਸੀਆਰ ਲਈ ਵਰਤੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ, 68 ਡਿਗਰੀ ਸੈਲਸੀਅਸ ਤੋਂ 72 ਡਿਗਰੀ ਸੈਲਸੀਅਸ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ ਵਧੀਆ ਕੰਮ ਕਰਦੇ ਹਨ।ਐਨਜ਼ਾਈਮ, ਹਾਲਾਂਕਿ, ਘੱਟ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ ਵੀ ਸਰਗਰਮ ਹੋ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਹਾਲਾਂਕਿ ਘੱਟ ਡਿਗਰੀ ਤੱਕ।ਐਨੀਲਿੰਗ ਤਾਪਮਾਨ ਤੋਂ ਬਹੁਤ ਹੇਠਾਂ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ, ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਗੈਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਤੌਰ 'ਤੇ ਬੰਨ੍ਹ ਸਕਦੇ ਹਨ ਅਤੇ ਗੈਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਵੱਲ ਲੈ ਜਾਂਦੇ ਹਨ, ਭਾਵੇਂ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਬਰਫ਼ 'ਤੇ ਸਥਾਪਤ ਕੀਤੀ ਗਈ ਹੋਵੇ।ਇਸ ਨੂੰ ਪੌਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਇਨਿਹਿਬਟਰਸ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਰੋਕਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ ਜੋ ਡੀਐਨਏ ਪੋਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਤੋਂ ਸਿਰਫ਼ ਇੱਕ ਵਾਰ ਇੱਕ ਨਿਸ਼ਚਿਤ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ ਪਹੁੰਚਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਵੱਖ ਹੋ ਜਾਂਦੇ ਹਨ, ਇਸਲਈ ਹਾਟ ਸਟਾਰਟ ਪੀਸੀਆਰ ਸ਼ਬਦ ਹੈ।ਇਨਿਹਿਬਟਰ ਇੱਕ ਐਂਟੀਬਾਡੀ ਹੋ ਸਕਦਾ ਹੈ ਜੋ ਪੋਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਅਤੇ ਡੈਨੇਚਰ ਨੂੰ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਵਿਨਾਸ਼ਕਾਰੀ ਤਾਪਮਾਨ (ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ 95°C) 'ਤੇ ਬੰਨ੍ਹਦਾ ਹੈ।

ਉੱਚ ਵਫ਼ਾਦਾਰੀ ਪੋਲੀਮੇਰੇਜ਼

ਜਦੋਂ ਕਿ ਡੀਐਨਏ ਪੋਲੀਮੇਰੇਸ ਅਸਲ ਟੈਂਪਲੇਟ ਕ੍ਰਮ ਨੂੰ ਕਾਫ਼ੀ ਸਹੀ ਢੰਗ ਨਾਲ ਵਧਾਉਂਦੇ ਹਨ, ਨਿਊਕਲੀਓਟਾਈਡ ਮੈਚਿੰਗ ਵਿੱਚ ਗਲਤੀਆਂ ਹੋ ਸਕਦੀਆਂ ਹਨ।ਐਪਲੀਕੇਸ਼ਨਾਂ ਵਿੱਚ ਮੇਲ ਨਹੀਂ ਖਾਂਦਾ ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਕਲੋਨਿੰਗ ਦੇ ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਕੱਟੇ ਹੋਏ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟਾਂ, ਅਤੇ ਗਲਤ ਅਨੁਵਾਦ ਜਾਂ ਅਕਿਰਿਆਸ਼ੀਲ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਹੇਠਾਂ ਵੱਲ ਹੋ ਸਕਦੇ ਹਨ।ਇਹਨਾਂ ਬੇਮੇਲਤਾਵਾਂ ਤੋਂ ਬਚਣ ਲਈ, "ਪਰੂਫ ਰੀਡਿੰਗ" ਗਤੀਵਿਧੀ ਵਾਲੇ ਪੌਲੀਮੇਰੇਸ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕੀਤੀ ਗਈ ਹੈ ਅਤੇ ਵਰਕਫਲੋ ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ ਕੀਤੀ ਗਈ ਹੈ।ਪਹਿਲੀ ਪਰੂਫ ਰੀਡਿੰਗ ਪੋਲੀਮੇਰੇਜ਼, Pfu, ਦੀ ਪਛਾਣ 1991 ਵਿੱਚ ਪਾਈਰੋਕੋਕਸ ਫਿਊਰੀਓਸਸ ਵਿੱਚ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਇਸ Pfu ਐਨਜ਼ਾਈਮ ਵਿੱਚ 3' ਤੋਂ 5' ਐਕਸੋਨੁਕਲੀਜ਼ ਗਤੀਵਿਧੀ ਹੁੰਦੀ ਹੈ।ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਡੀਐਨਏ ਨੂੰ ਵਧਾਇਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਐਕਸੋਨਯੂਕਲੀਜ਼ ਸਟ੍ਰੈਂਡ ਦੇ 3' ਸਿਰੇ 'ਤੇ ਮੇਲ ਖਾਂਦੀਆਂ ਨਿਊਕਲੀਓਟਾਈਡਾਂ ਨੂੰ ਹਟਾਉਂਦਾ ਹੈ।ਸਹੀ ਨਿਊਕਲੀਓਟਾਈਡ ਨੂੰ ਫਿਰ ਬਦਲਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਡੀਐਨਏ ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਜਾਰੀ ਰਹਿੰਦਾ ਹੈ।ਗਲਤ ਨਿਊਕਲੀਓਟਾਈਡ ਕ੍ਰਮ ਦੀ ਪਛਾਣ ਐਨਜ਼ਾਈਮ ਦੇ ਨਾਲ ਸਹੀ ਨਿਊਕਲੀਓਸਾਈਡ ਟ੍ਰਾਈਫਾਸਫੇਟ ਲਈ ਬਾਈਡਿੰਗ ਸਬੰਧਾਂ 'ਤੇ ਅਧਾਰਤ ਹੈ, ਜਿੱਥੇ ਅਕੁਸ਼ਲ ਬਾਈਡਿੰਗ ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਨੂੰ ਹੌਲੀ ਕਰ ਦਿੰਦੀ ਹੈ ਅਤੇ ਸਹੀ ਤਬਦੀਲੀ ਦੀ ਆਗਿਆ ਦਿੰਦੀ ਹੈ।Pfu ਪੌਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਦੀ ਪਰੂਫ ਰੀਡਿੰਗ ਗਤੀਵਿਧੀ ਦੇ ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਤਾਕ ਡੀਐਨਏ ਪੋਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ ਅੰਤਮ ਕ੍ਰਮ ਵਿੱਚ ਘੱਟ ਗਲਤੀਆਂ ਹੁੰਦੀਆਂ ਹਨ।ਹਾਲ ਹੀ ਦੇ ਸਾਲਾਂ ਵਿੱਚ, ਹੋਰ ਪਰੂਫ ਰੀਡਿੰਗ ਐਨਜ਼ਾਈਮ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕੀਤੀ ਗਈ ਹੈ, ਅਤੇ ਡੀਐਨਏ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਦੌਰਾਨ ਗਲਤੀ ਦਰ ਨੂੰ ਹੋਰ ਘਟਾਉਣ ਲਈ ਮੂਲ Pfu ਐਨਜ਼ਾਈਮ ਦੀਆਂ ਸੋਧਾਂ ਕੀਤੀਆਂ ਗਈਆਂ ਹਨ।

RT-PCR

ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ PCR, ਜਾਂ RT-PCR, ਇੱਕ ਟੈਪਲੇਟ ਦੇ ਤੌਰ 'ਤੇ RNA ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਦੀ ਇਜਾਜ਼ਤ ਦਿੰਦਾ ਹੈ।ਇੱਕ ਵਾਧੂ ਕਦਮ RNA ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾਉਣ ਅਤੇ ਵਧਾਉਣ ਦੀ ਆਗਿਆ ਦਿੰਦਾ ਹੈ।ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟੇਜ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ, ਆਰਐਨਏ ਨੂੰ ਪੂਰਕ ਡੀਐਨਏ (ਸੀਡੀਐਨਏ) ਵਿੱਚ ਉਲਟਾਇਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।RT-PCR ਦੀ ਸਫਲਤਾ ਲਈ RNA ਟੈਂਪਲੇਟ ਦੀ ਗੁਣਵੱਤਾ ਅਤੇ ਸ਼ੁੱਧਤਾ ਜ਼ਰੂਰੀ ਹੈ।RT-PCR ਦਾ ਪਹਿਲਾ ਕਦਮ ਇੱਕ DNA/RNA ਹਾਈਬ੍ਰਿਡ ਦਾ ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਹੈ।ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟਸ ਵਿੱਚ ਇੱਕ RNase H ਫੰਕਸ਼ਨ ਵੀ ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਜੋ ਹਾਈਬ੍ਰਿਡ ਦੇ RNA ਹਿੱਸੇ ਨੂੰ ਘਟਾਉਂਦਾ ਹੈ।ਸਿੰਗਲ-ਸਟ੍ਰੈਂਡਡ ਡੀਐਨਏ ਅਣੂ ਨੂੰ ਫਿਰ ਡੀਐਨਏ-ਨਿਰਭਰ ਡੀਐਨਏ ਪੋਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਗਤੀਵਿਧੀ ਦੁਆਰਾ ਸੀਡੀਐਨਏ ਵਿੱਚ ਉਲਟਾ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟੇਜ ਦੁਆਰਾ ਪੂਰਾ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਪਹਿਲੀ-ਸਟ੍ਰੈਂਡ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਦੀ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਨੂੰ ਪ੍ਰਭਾਵਤ ਕਰ ਸਕਦੀ ਹੈ।ਇੱਥੋਂ, ਮਿਆਰੀ ਪੀਸੀਆਰ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਸੀਡੀਐਨਏ ਨੂੰ ਵਧਾਉਣ ਲਈ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ।RT-PCR ਦੁਆਰਾ RNA ਨੂੰ cDNA ਵਿੱਚ ਵਾਪਸ ਕਰਨ ਦੀ ਸੰਭਾਵਨਾ ਦੇ ਬਹੁਤ ਸਾਰੇ ਫਾਇਦੇ ਹਨ, ਅਤੇ ਇਹ ਮੁੱਖ ਤੌਰ 'ਤੇ ਜੀਨ ਸਮੀਕਰਨ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਲਈ ਵਰਤਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।RNA ਸਿੰਗਲ-ਸਟੈਂਡਡ ਅਤੇ ਬਹੁਤ ਅਸਥਿਰ ਹੈ, ਜਿਸ ਨਾਲ ਇਸ ਨਾਲ ਕੰਮ ਕਰਨਾ ਚੁਣੌਤੀਪੂਰਨ ਹੁੰਦਾ ਹੈ।ਇਹ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ qPCR ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਪਹਿਲੇ ਕਦਮ ਵਜੋਂ ਕੰਮ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਜੋ ਇੱਕ ਜੀਵ-ਵਿਗਿਆਨਕ ਨਮੂਨੇ ਵਿੱਚ RNA ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟਾਂ ਨੂੰ ਮਾਪਦਾ ਹੈ।

qPCR ਅਤੇ RT-qPCR

ਕੁਆਂਟੀਟੇਟਿਵ ਪੀਸੀਆਰ (qPCR) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਈ ਐਪਲੀਕੇਸ਼ਨਾਂ ਲਈ ਨਿਊਕਲੀਕ ਐਸਿਡ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾਉਣ, ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਅਤੇ ਮਾਤਰਾ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨ ਲਈ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ।RT-qPCR ਵਿੱਚ, RNA ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟਾਂ ਨੂੰ ਅਕਸਰ ਪਹਿਲਾਂ ਉਹਨਾਂ ਨੂੰ cDNA ਵਿੱਚ ਉਲਟਾ ਕੇ ਮਾਪਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਜਿਵੇਂ ਉੱਪਰ ਦੱਸਿਆ ਗਿਆ ਹੈ, ਅਤੇ ਫਿਰ qPCR ਨੂੰ ਬਾਅਦ ਵਿੱਚ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਸਟੈਂਡਰਡ ਪੀਸੀਆਰ ਵਿੱਚ, ਡੀਐਨਏ ਨੂੰ ਤਿੰਨ ਦੁਹਰਾਉਣ ਵਾਲੇ ਕਦਮਾਂ ਦੁਆਰਾ ਵਧਾਇਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ: ਵਿਨਾਸ਼ਕਾਰੀ, ਐਨੀਲਿੰਗ, ਅਤੇ ਲੰਬਾਈ।ਹਾਲਾਂਕਿ, qPCR ਵਿੱਚ, ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਲੇਬਲਿੰਗ PCR ਦੇ ਅੱਗੇ ਵਧਣ ਦੇ ਨਾਲ ਡੇਟਾ ਨੂੰ ਇਕੱਠਾ ਕਰਨ ਦੇ ਯੋਗ ਬਣਾਉਂਦੀ ਹੈ।ਉਪਲਬਧ ਤਰੀਕਿਆਂ ਅਤੇ ਰਸਾਇਣਾਂ ਦੀ ਸ਼੍ਰੇਣੀ ਦੇ ਕਾਰਨ ਇਸ ਤਕਨੀਕ ਦੇ ਬਹੁਤ ਸਾਰੇ ਫਾਇਦੇ ਹਨ।

ਡਾਈ-ਅਧਾਰਤ qPCR (ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਹਰੇ) ਵਿੱਚ, ਫਲੋਰੋਸੈੰਟ ਲੇਬਲਿੰਗ ਇੱਕ dsDNA ਬਾਈਡਿੰਗ ਡਾਈ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਵਿਸਤ੍ਰਿਤ DNA ਅਣੂਆਂ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨ ਦੀ ਆਗਿਆ ਦਿੰਦੀ ਹੈ।ਹਰੇਕ ਚੱਕਰ ਦੇ ਦੌਰਾਨ, ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਨੂੰ ਮਾਪਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਸਿਗਨਲ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਤ ਡੀਐਨਏ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਦੇ ਅਨੁਪਾਤਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਵਧਦਾ ਹੈ।ਇਸ ਲਈ, ਡੀਐਨਏ ਨੂੰ "ਰੀਅਲ-ਟਾਈਮ" (ਚਿੱਤਰ 3) ਵਿੱਚ ਮਾਪਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਡਾਈ-ਅਧਾਰਿਤ qPCR ਦੇ ਨੁਕਸਾਨ ਇਹ ਹਨ ਕਿ ਇੱਕ ਸਮੇਂ ਵਿੱਚ ਸਿਰਫ ਇੱਕ ਨਿਸ਼ਾਨਾ ਦੀ ਜਾਂਚ ਕੀਤੀ ਜਾ ਸਕਦੀ ਹੈ ਅਤੇ ਇਹ ਕਿ ਰੰਗ ਨਮੂਨੇ ਵਿੱਚ ਮੌਜੂਦ ਕਿਸੇ ਵੀ ds-DNA ਨਾਲ ਬੰਨ੍ਹੇਗਾ।

ਪੜਤਾਲ-ਅਧਾਰਿਤ qPCR ਵਿੱਚ, ਹਰੇਕ ਨਮੂਨੇ ਵਿੱਚ ਇੱਕੋ ਸਮੇਂ ਬਹੁਤ ਸਾਰੇ ਟੀਚਿਆਂ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾਇਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਪਰ ਇਸ ਲਈ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ ਵਰਤੇ ਗਏ ਟੀਚੇ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਜਾਂਚ(ਆਂ) ਦੇ ਅਨੁਕੂਲਨ ਅਤੇ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਦੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ।ਕਈ ਕਿਸਮਾਂ ਦੀਆਂ ਪੜਤਾਲਾਂ ਦੇ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਉਪਲਬਧ ਹਨ, ਪਰ ਸਭ ਤੋਂ ਆਮ ਕਿਸਮ ਇੱਕ ਹਾਈਡੋਲਿਸਿਸ ਪੜਤਾਲ ਹੈ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਫਲੋਰੋਫੋਰ ਅਤੇ ਕੁੰਜਰ ਸ਼ਾਮਲ ਹੁੰਦਾ ਹੈ।ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਰੈਜ਼ੋਨੈਂਸ ਐਨਰਜੀ ਟ੍ਰਾਂਸਫਰ (FRET) ਜਾਂਚ ਬਰਕਰਾਰ ਹੋਣ ਦੇ ਦੌਰਾਨ ਕਨਨਰ ਦੁਆਰਾ ਫਲੋਰੋਫੋਰ ਦੇ ਨਿਕਾਸ ਨੂੰ ਰੋਕਦਾ ਹੈ।ਹਾਲਾਂਕਿ, ਪੀਸੀਆਰ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਦੇ ਦੌਰਾਨ, ਪ੍ਰੋਬ ਨੂੰ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਐਕਸਟੈਂਸ਼ਨ ਦੇ ਦੌਰਾਨ ਹਾਈਡ੍ਰੋਲਾਈਜ਼ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਖਾਸ ਕ੍ਰਮ ਦੀ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਜਿਸ ਨਾਲ ਇਹ ਬੰਨ੍ਹਿਆ ਹੋਇਆ ਹੈ।ਪੜਤਾਲ ਦਾ ਕਲੀਵੇਜ ਫਲੋਰੋਫੋਰ ਨੂੰ ਕਵੇਨਕਰ ਤੋਂ ਵੱਖ ਕਰਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ (ਚਿੱਤਰ 4) ਵਿੱਚ ਵਾਧਾ-ਨਿਰਭਰ ਵਾਧਾ ਹੁੰਦਾ ਹੈ।ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ, ਇੱਕ ਪੜਤਾਲ-ਅਧਾਰਿਤ qPCR ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਤੋਂ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਸਿਗਨਲ ਨਮੂਨੇ ਵਿੱਚ ਮੌਜੂਦ ਜਾਂਚ ਟੀਚੇ ਦੇ ਕ੍ਰਮ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਦੇ ਅਨੁਪਾਤੀ ਹੈ।ਕਿਉਂਕਿ ਪੜਤਾਲ-ਅਧਾਰਿਤ qPCR ਡਾਈ-ਅਧਾਰਿਤ qPCR ਨਾਲੋਂ ਵਧੇਰੇ ਖਾਸ ਹੈ, ਇਹ ਅਕਸਰ qPCR-ਅਧਾਰਤ ਡਾਇਗਨੌਸਟਿਕ ਅਸੈਸ ਵਿੱਚ ਵਰਤੀ ਜਾਂਦੀ ਤਕਨਾਲੋਜੀ ਹੈ।

ਆਈਸੋਥਰਮਲ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ

ਉੱਪਰ ਦੱਸੀਆਂ ਗਈਆਂ ਤਕਨੀਕਾਂ ਲਈ ਪੀਸੀਆਰ ਲਈ ਮਹਿੰਗੇ ਥਰਮੋਸਾਈਕਲਿੰਗ ਉਪਕਰਣਾਂ ਦੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ ਤਾਂ ਜੋ ਡੈਨੇਚਰੇਸ਼ਨ, ਐਨੀਲਿੰਗ, ਅਤੇ ਐਕਸਟੈਂਸ਼ਨ ਕਦਮਾਂ ਲਈ ਚੈਂਬਰ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ ਨੂੰ ਸਹੀ ਢੰਗ ਨਾਲ ਰੈਂਪ ਅਤੇ ਡਾਊਨ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕੇ।ਬਹੁਤ ਸਾਰੀਆਂ ਤਕਨੀਕਾਂ ਵਿਕਸਿਤ ਕੀਤੀਆਂ ਗਈਆਂ ਹਨ ਜਿਨ੍ਹਾਂ ਨੂੰ ਅਜਿਹੇ ਸਟੀਕ ਯੰਤਰਾਂ ਦੀ ਲੋੜ ਨਹੀਂ ਹੈ ਅਤੇ ਇੱਕ ਸਧਾਰਨ ਪਾਣੀ ਦੇ ਇਸ਼ਨਾਨ ਵਿੱਚ ਜਾਂ ਦਿਲਚਸਪੀ ਵਾਲੇ ਸੈੱਲਾਂ ਦੇ ਅੰਦਰ ਵੀ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਇਹਨਾਂ ਤਕਨੀਕਾਂ ਨੂੰ ਸਮੂਹਿਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਆਈਸੋਥਰਮਲ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਕਿਹਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਘਾਤਕ, ਰੇਖਿਕ, ਜਾਂ ਕੈਸਕੇਡ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ 'ਤੇ ਆਧਾਰਿਤ ਕੰਮ ਕਰਦੇ ਹਨ।

ਆਈਸੋਥਰਮਲ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਦੀ ਸਭ ਤੋਂ ਮਸ਼ਹੂਰ ਕਿਸਮ ਲੂਪ-ਮੀਡੀਏਟਿਡ ਆਈਸੋਥਰਮਲ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ, ਜਾਂ LAMP ਹੈ।LAMP ਟੈਂਪਲੇਟ DNA ਜਾਂ RNA ਨੂੰ ਵਧਾਉਣ ਲਈ 65⁰C 'ਤੇ ਐਕਸਪੋਨੈਂਸ਼ੀਅਲ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦਾ ਹੈ।LAMP ਕਰਨ ਵੇਲੇ, ਟੀਚੇ ਵਾਲੇ DNA ਦੇ ਖੇਤਰਾਂ ਦੇ ਪੂਰਕ ਚਾਰ ਤੋਂ ਛੇ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਨਵੇਂ DNA ਦੇ ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਲਈ ਇੱਕ DNA ਪੌਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਨਾਲ ਵਰਤੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ।ਇਹਨਾਂ ਵਿੱਚੋਂ ਦੋ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਵਿੱਚ ਮੁਫਤ ਕ੍ਰਮ ਹੁੰਦੇ ਹਨ ਜੋ ਦੂਜੇ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਵਿੱਚ ਤਰਤੀਬਾਂ ਨੂੰ ਪਛਾਣਦੇ ਹਨ ਅਤੇ ਉਹਨਾਂ ਨੂੰ ਬੰਨ੍ਹਦੇ ਹਨ, ਨਵੇਂ ਸੰਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਵਾਲੇ ਡੀਐਨਏ ਵਿੱਚ ਇੱਕ "ਲੂਪ" ਬਣਤਰ ਬਣਾਉਣ ਦੀ ਆਗਿਆ ਦਿੰਦੇ ਹਨ ਜੋ ਫਿਰ ਪ੍ਰਸਾਰ ਦੇ ਬਾਅਦ ਦੇ ਦੌਰ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਐਨੀਲਿੰਗ ਦੀ ਸਹਾਇਤਾ ਕਰਦਾ ਹੈ।LAMP ਨੂੰ ਕਈ ਤਰੀਕਿਆਂ ਦੁਆਰਾ ਕਲਪਨਾ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ, ਐਗਰੋਜ਼ ਜੈੱਲ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਫੋਰੇਸਿਸ, ਜਾਂ ਕਲੋਰੀਮੈਟਰੀ ਸ਼ਾਮਲ ਹੈ।ਕਲੋਰੀਮੈਟਰੀ ਦੁਆਰਾ ਉਤਪਾਦ ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਜਾਂ ਗੈਰਹਾਜ਼ਰੀ ਦੀ ਕਲਪਨਾ ਅਤੇ ਪਤਾ ਲਗਾਉਣ ਦੀ ਸੌਖ ਅਤੇ ਲੋੜੀਂਦੇ ਮਹਿੰਗੇ ਉਪਕਰਣਾਂ ਦੀ ਘਾਟ ਨੇ LAMP ਨੂੰ ਉਹਨਾਂ ਖੇਤਰਾਂ ਵਿੱਚ SARS-CoV-2 ਟੈਸਟਿੰਗ ਲਈ ਇੱਕ ਢੁਕਵਾਂ ਵਿਕਲਪ ਬਣਾਇਆ ਜਿੱਥੇ ਕਲੀਨਿਕਲ ਲੈਬ ਟੈਸਟਿੰਗ ਆਸਾਨੀ ਨਾਲ ਉਪਲਬਧ ਨਹੀਂ ਸੀ, ਜਾਂ ਨਮੂਨਿਆਂ ਦੀ ਸਟੋਰੇਜ ਅਤੇ ਟ੍ਰਾਂਸਪੋਰਟ ਸੰਭਵ ਨਹੀਂ ਸੀ, ਜਾਂ ਉਹਨਾਂ ਲੈਬਾਂ ਵਿੱਚ ਜਿਹਨਾਂ ਵਿੱਚ ਪਹਿਲਾਂ ਪੀਸੀਆਰ ਥਰਮੋਸਾਈਕਲਿੰਗ ਉਪਕਰਣ ਨਹੀਂ ਸਨ।