RT-qPCR ਅਣੂ ਜੀਵ ਵਿਗਿਆਨ ਦਾ ਮੂਲ ਪ੍ਰਯੋਗ ਹੈ, ਅਤੇ ਹਰ ਕੋਈ ਇਸ ਤੋਂ ਜਾਣੂ ਹੋਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ।ਇਸ ਵਿੱਚ ਮੁੱਖ ਤੌਰ 'ਤੇ ਤਿੰਨ ਪੜਾਅ ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ: ਆਰਐਨਏ ਐਕਸਟਰੈਕਸ਼ਨ, ਸੀਡੀਐਨਏ ਵਿੱਚ ਉਲਟਾ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ, ਅਤੇ ਰੀਅਲ-ਟਾਈਮ ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਮਾਤਰਾਤਮਕ ਪੀਸੀਆਰ।ਇਹ ਮਦਦ ਨਹੀਂ ਕਰਦਾ, ਕੀ ਹੋ ਰਿਹਾ ਹੈ?ਇਸ ਦੇ ਨਾਲ ਇੱਕ ਸਮੱਸਿਆ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ ਸੰਭਾਵਨਾ ਹੈਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਪ੍ਰਯੋਗ!ਹਾਲਾਂਕਿ ਇਹ ਜਾਪਦਾ ਹੈ ਕਿ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਪ੍ਰਯੋਗ ਨੂੰ ਸਿਰਫ ਆਰਐਨਏ, ਡੀਐਨਟੀਪੀ, ਪ੍ਰਾਈਮਰ, ਅਤੇ ਜੋੜਨ ਦੀ ਜ਼ਰੂਰਤ ਹੈਉਲਟਾ ਪ੍ਰਤੀਲਿਪੀਸੈਂਟਰਿਫਿਊਜ ਟਿਊਬ ਤੱਕ ਅਤੇ ਚੰਗੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਮਿਲਾਓ, ਪਰ ਅਸਲ ਕਾਰਵਾਈ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਵਿੱਚ, ਅਜੇ ਵੀ ਬਹੁਤ ਸਾਰੇ ਵੇਰਵੇ ਹਨ ਜਿਨ੍ਹਾਂ ਵੱਲ ਧਿਆਨ ਦੇਣ ਦੀ ਲੋੜ ਹੈ।ਆਓ ਇਸ ਬਾਰੇ ਸਿੱਖੀਏ!

RNA ਦੀ ਗੁਣਵੱਤਾ ਦਾ ਨਿਰਣਾ ਕਿਵੇਂ ਕਰੀਏ?
ਸੀਡੀਐਨਏ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਨ ਲਈ, ਆਰਐਨਏ ਦੀ ਗੁਣਵੱਤਾ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਹੈ!ਆਰਐਨਏ ਗੁਣਵੱਤਾ ਨੂੰ ਮੁੱਖ ਤੌਰ 'ਤੇ ਦੋ ਪਹਿਲੂਆਂ ਤੋਂ ਖੋਜਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ:
(1) RNA ਇਕਸਾਰਤਾ:ਆਰਐਨਏ ਦੀ ਇਕਸਾਰਤਾ ਨੂੰ ਐਗਰੋਸ ਜੈੱਲ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਫੋਰੇਸਿਸ ਦੁਆਰਾ ਪ੍ਰਮਾਣਿਤ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ. ਯੂਕੇਰੀਓਟਸ ਨੂੰ ਇੱਕ ਉਦਾਹਰਨ ਵਜੋਂ ਲੈਂਦੇ ਹੋਏ, ਪੂਰੇ ਕੁੱਲ RNA ਵਿੱਚ ਤਿੰਨ ਸਪੱਸ਼ਟ ਬੈਂਡ ਹੁੰਦੇ ਹਨ, ਵੱਡੇ ਤੋਂ ਛੋਟੇ ਤੱਕ ਦੇ ਅਣੂ ਭਾਰ 28S, 18S, ਅਤੇ 5S ਹਨ, ਅਤੇ 28S 18S ਨਾਲੋਂ ਦੁੱਗਣਾ ਚਮਕਦਾਰ ਹੁੰਦਾ ਹੈ;ਜੇਕਰ ਤਿੰਨ ਬੈਂਡ ਦੇਖੇ ਜਾ ਸਕਦੇ ਹਨ, ਪਰ ਬੈਂਡ ਦੀ ਕਿਸਮ ਧੁੰਦਲੀ ਹੈ ਜਾਂ ਫੈਲਣ ਦਾ ਮਤਲਬ ਹੈ ਕਿ ਆਰਐਨਏ ਅੰਸ਼ਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਡਿਗਰੇਡ ਹੈ।ਇਸ ਸਮੇਂ, ਕਿਰਪਾ ਕਰਕੇ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਤੁਰੰਤ ਕਰੋ ਅਤੇ ਟੈਂਪਲੇਟ ਇੰਪੁੱਟ ਨੂੰ ਸਹੀ ਢੰਗ ਨਾਲ ਵਧਾਓ;ਜੇ ਸਿਰਫ ਇੱਕ ਛੋਟੇ ਅਣੂ ਭਾਰ ਵਾਲਾ ਬੈਂਡ ਜਾਂ ਕੋਈ ਬੈਂਡ ਨਹੀਂ ਦੇਖਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਤਾਂ RNA ਪੂਰੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਡਿਗਰੇਡ ਹੋ ਗਿਆ ਹੈ ਅਤੇ ਇਸਨੂੰ ਦੁਬਾਰਾ ਕੱਢਣ ਦੀ ਲੋੜ ਹੈ।Agilent 2100 ਪੀਕ ਡਾਇਗ੍ਰਾਮ ਅਤੇ RIN ਮੁੱਲ ਦੇ ਨਾਲ RNA ਦੀ ਇਕਸਾਰਤਾ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ।ਜੇਕਰ ਨਿਊਕਲੀਕ ਐਸਿਡ ਬਰਕਰਾਰ ਹੈ, ਤਾਂ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਫੇਰੋਗ੍ਰਾਮ ਦੀ ਬੇਸਲਾਈਨ ਸਮਤਲ ਹੈ;ਜੇਕਰ ਨਿਊਕਲੀਕ ਐਸਿਡ ਬੁਰੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਡਿਗਰੇਡ ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਤਾਂ ਬੇਸਲਾਈਨ ਅਸਮਾਨ ਹੁੰਦੀ ਹੈ ਅਤੇ ਹੋਰ ਡਿਗਰੇਡੇਸ਼ਨ ਸਿਖਰ ਦਿਖਾਈ ਦਿੰਦੇ ਹਨ;RIN ਦਾ ਮੁੱਲ RNA ਦੀ ਇਕਸਾਰਤਾ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ, 0-10 ਦੀ ਰੇਂਜ ਦੇ ਅੰਦਰ, ਮੁੱਲ ਜਿੰਨਾ ਵੱਡਾ ਹੋਵੇਗਾ, RNA ਦੀ ਗੁਣਵੱਤਾ ਓਨੀ ਹੀ ਬਿਹਤਰ ਹੋਵੇਗੀ।ਖੈਰ, ਸੰਪੂਰਨਤਾ ਦੀ ਉੱਚ ਡਿਗਰੀ.
(2) RNA ਦੀ ਸ਼ੁੱਧਤਾ:OD260/280 ਦਾ ਅਨੁਪਾਤ UV ਸਪੈਕਟਰੋਫੋਟੋਮੈਟਰੀ ਦੁਆਰਾ ਖੋਜਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਜੇਕਰ OD260/280 ਦਾ ਅਨੁਪਾਤ 1.9 ਅਤੇ 2.1 ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਹੈ, ਤਾਂ ਸ਼ੁੱਧਤਾ ਬਹੁਤ ਵਧੀਆ ਹੈ।
ਬਚੇ ਹੋਏ ਜੀਨੋਮਿਕ ਡੀਐਨਏ ਗਲਤ ਮਾਤਰਾਤਮਕ ਨਤੀਜਿਆਂ ਦੀ ਅਗਵਾਈ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹਨ
ਜਦੋਂ ਆਰਐਨਏ ਕੱਢਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਤਾਂ ਸਾਨੂੰ ਜੋ ਆਰਐਨਏ ਮਿਲਦਾ ਹੈ ਉਹ ਜੀਨੋਮਿਕ ਡੀਐਨਏ (ਜੀਡੀਐਨਏ) ਨਾਲ ਮਿਲਾਇਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ ਜੋ ਸਾਫ਼ ਨਹੀਂ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ।ਇਸ ਲਈ, ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਸੀਡੀਐਨਏ ਨੂੰ ਵੀ ਮਿਲਾਇਆ ਜਾਵੇਗਾgDNA.ਡਾਊਨਸਟ੍ਰੀਮ ਦੌਰਾਨqPCRਪ੍ਰਤੀਕਰਮ,cDNAਅਤੇ gDNA ਨੂੰ ਇੱਕੋ ਸਮੇਂ ਵਧਾਇਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਇੱਕ ਮੁਕਾਬਲਤਨ ਛੋਟਾ CT ਮੁੱਲ ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਇਸਲਈ ਨਤੀਜੇ ਪੱਖਪਾਤੀ ਹੋ ਸਕਦੇ ਹਨ।
ਇਸ ਲਈ ਸਾਨੂੰ ਇਸ ਸਥਿਤੀ ਵਿੱਚ ਕੀ ਕਰਨਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ?ਫੋਰਜੀਨਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦਾ ਹੈ:
(1) ਉਲਟੇ ਹੋਏ RNA 'ਤੇ ਜੀਨੋਮ ਦੀ ਸਫਾਈ ਕਰੋ, ਜਿਸ ਨੂੰ RNA ਕੱਢਣ ਦੌਰਾਨ ਕਾਲਮ ਕੱਢਣ ਦੁਆਰਾ ਹਟਾਇਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ;
(2) ਕੱਢੇ ਹੋਏ RNA ਦਾ DNase ਨਾਲ ਇਲਾਜ ਕਰੋI , ਪਰ ਇਸਨੂੰ EDTA ਨਾਲ ਖਤਮ ਕਰੋ;
ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਰੀਐਜੈਂਟਸ ਦਾਜੀਨੋਮ ਕਲੀਅਰਿੰਗ ਮੋਡੀਊਲ ਦੇ ਨਾਲ;

ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਲਈ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਕਿਵੇਂ ਚੁਣੀਏ?
ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਦੇ ਨਤੀਜੇ ਨੂੰ ਵੀ ਪ੍ਰਭਾਵਿਤ ਕਰਦੇ ਹਨ।ਤੁਸੀਂ ਪ੍ਰਯੋਗ ਦੀਆਂ ਖਾਸ ਸਥਿਤੀਆਂ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਲਈ ਬੇਤਰਤੀਬ ਪ੍ਰਾਈਮਰ, ਓਲੀਗੋ ਡੀਟੀ ਜਾਂ ਜੀਨ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਚੁਣ ਸਕਦੇ ਹੋ:
(1) ਖਾਸ ਪ੍ਰਤੀਲਿਪੀ: ਜੀਨ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਦੀ ਸਿਫਾਰਸ਼ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ;
(2) ਲੰਬੇ ਟੁਕੜੇ ਪ੍ਰਤੀਲਿਪੀ: ਓਲੀਗੋ ਡੀਟੀ/ਜੀਨ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਦੀ ਸਿਫ਼ਾਰਸ਼ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ;
(3) ਲੰਬੇ-ਖੰਡ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟਾਂ ਦੇ ਅੰਦਰੂਨੀ ਟੁਕੜੇ: ਜੀਨ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਪ੍ਰਾਈਮਰ/ਰੈਂਡਮ ਪ੍ਰਾਈਮਰ/ਰੈਂਡਮ ਪ੍ਰਾਈਮਰ + ਓਲੀਗੋ ਡੀ.ਟੀ.ਜੇਕਰ ਬਾਅਦ ਦਾ qPCR ਪ੍ਰਯੋਗ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਤਾਂ Oligo dT ਨੂੰ ਇਕੱਲੇ ਨਹੀਂ ਵਰਤਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਕਿਉਂਕਿ Oligo dT ਨੂੰ ਇਕੱਲੇ ਵਰਤਣ ਨਾਲ 3′ ਅੰਤ ਪੱਖਪਾਤ ਹੋ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਜਿਸ ਨਾਲ ਗਲਤ qPCR ਪ੍ਰਯੋਗ ਦੇ ਨਤੀਜੇ ਨਿਕਲਦੇ ਹਨ;
(4) miRNA: ਸਟੈਮ-ਲੂਪ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਜਾਂ ਟੇਲਿੰਗ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਵਰਤੇ ਜਾ ਸਕਦੇ ਹਨ।

ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਉਤਪਾਦ cDNA ਨੂੰ ਮਾਤਰਾ ਲਈ ਕਿੰਨੀ ਵਾਰ ਪਤਲਾ ਕੀਤਾ ਜਾਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ?
ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਉਤਪਾਦ ਦਾ cDNA ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, qPCR ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਲਈ cDNA ਨੂੰ ਕਿੰਨੀ ਵਾਰ ਪਤਲਾ ਕੀਤਾ ਜਾਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ, ਇਹ ਬਹੁਤ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਹੈ।ਜੇ ਸੀਡੀਐਨਏ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਜਾਂ ਬਹੁਤ ਘੱਟ ਹੈ, ਤਾਂ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਪ੍ਰਭਾਵਿਤ ਹੋ ਸਕਦੀ ਹੈ।ਕੀ cDNA ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਨੂੰ ਮਾਪਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਇਹ ਕਿਵੇਂ ਕੀਤਾ ਜਾਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ?
(1) ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਉਤਪਾਦ ਦੀ cDNA ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਨੂੰ ਮਾਪਿਆ ਨਹੀਂ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਕਿਉਂਕਿ cDNA ਉਤਪਾਦ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਉਤਪਾਦ ਵਿੱਚ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਬਫਰ, ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟੇਜ, ਪ੍ਰਾਈਮਰ, ਆਦਿ ਵੀ ਸ਼ਾਮਲ ਹੁੰਦੇ ਹਨ, ਜੋ ਕਿ ਇਕਾਗਰਤਾ ਮਾਪ ਦੇ ਨਤੀਜਿਆਂ ਵਿੱਚ ਦਖਲਅੰਦਾਜ਼ੀ ਕਰਨਗੇ ਅਤੇ ਇਸਲਈ OD260/280, OD260/280 ਅਤੇ abn236, abnratio, abn236 ਨੂੰ ਪ੍ਰਤੀਬਿੰਬਿਤ ਨਹੀਂ ਕਰਦੇ ਹਨ। ਖੇਤਰਇਸ ਸਮੇਂ ਕੁਝ ਦੋਸਤ ਕਹਿਣਗੇ, ਮੈਂ ਸ਼ੁੱਧਤਾ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਇਕਾਗਰਤਾ ਨੂੰ ਮਾਪਾਂਗਾ;ਇੱਥੇ, ਫੋਰਜੀਨ ਯਾਦ ਦਿਵਾਉਣਾ ਚਾਹੇਗਾ ਕਿ ਸੀਡੀਐਨਏ ਨੂੰ ਸ਼ੁੱਧ ਕਰਨ ਦੀ ਸਿਫ਼ਾਰਸ਼ ਨਹੀਂ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ, ਕਿਉਂਕਿ ਰਿਵਰਸਲ ਦੁਆਰਾ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸੀਡੀਐਨਏ ਦੀ ਲੰਬਾਈ ਵੱਖਰੀ ਹੁੰਦੀ ਹੈ, ਅਤੇ ਛੋਟਾ ਸੀਡੀਐਨਏ ਸ਼ੁੱਧੀਕਰਨ ਵਿੱਚ ਖਤਮ ਹੋ ਜਾਵੇਗਾ।
(2) ਤਾਂ ਕੀ ਕਰੀਏ?qPCR ਪ੍ਰਯੋਗ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ, ਪੂਰਵ-ਪ੍ਰਯੋਗ ਦੁਆਰਾ cDNA ਦੇ ਪਤਲੇ ਗਰੇਡੀਐਂਟ ਨੂੰ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਉਦਾਹਰਨ ਲਈ: qPCR ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਲਈ ਟੈਂਪਲੇਟਾਂ ਦੇ ਤੌਰ 'ਤੇ cDNA ਸਟਾਕ ਹੱਲ, 10-ਗੁਣਾ ਪਤਲਾ, ਅਤੇ 100-ਗੁਣਾ ਪਤਲਾ ਵਰਤੋ, ਅਤੇ 18-28 ਦੀ ਰੇਂਜ ਵਿੱਚ CT ਮੁੱਲ ਦੇ ਨਾਲ ਪਤਲਾ ਫੈਕਟਰ ਚੁਣੋ।

miRNAs ਨੂੰ ਉਲਟਾ ਕਿਵੇਂ ਲਿਖਿਆ ਜਾਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ?
miRNA ਲਗਭਗ 22 nt ਦੇ ਆਕਾਰ ਵਾਲਾ ਇੱਕ ਸਿੰਗਲ-ਸਟ੍ਰੈਂਡਡ ਛੋਟਾ ਅਣੂ RNA ਹੈ ਜੋ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਲਈ ਕੋਡ ਨਹੀਂ ਕਰਦਾ ਹੈ।ਇਸਦੀ ਛੋਟੀ ਲੰਬਾਈ ਦੇ ਕਾਰਨ, ਰਵਾਇਤੀ qPCR ਵਿਧੀ ਦੁਆਰਾ ਇਸਨੂੰ ਸਿੱਧੇ ਤੌਰ 'ਤੇ ਮਾਪਣਾ ਮੁਸ਼ਕਲ ਹੈ, ਇਸਲਈ ਅਕਸਰ miRNA ਨੂੰ ਵਧਾਉਣਾ ਜ਼ਰੂਰੀ ਹੁੰਦਾ ਹੈ;miRNA ਲਈ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਵਰਤੇ ਜਾਂਦੇ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਵਿਧੀਆਂ ਵਿੱਚ ਸਟੈਮ-ਲੂਪ ਵਿਧੀ ਅਤੇ ਟੇਲਿੰਗ ਵਿਧੀ ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ।
ਸਟੈਮ-ਲੂਪ ਵਿਧੀ ਸਟੈਮ-ਲੂਪ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਨੂੰ ਜੋੜ ਕੇ miRNA ਨੂੰ ਵਧਾਉਣਾ ਹੈ।ਇਸ ਖੋਜ ਵਿਧੀ ਵਿੱਚ ਵਧੇਰੇ ਸੰਵੇਦਨਸ਼ੀਲਤਾ ਅਤੇ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਹੈ, ਪਰ ਖੋਜ ਦਾ ਥ੍ਰੋਪੁੱਟ ਘੱਟ ਹੈ।ਇੱਕ ਉਲਟਾ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਕੇਵਲ ਇੱਕ miRNA ਅਤੇ ਇੱਕ ਅੰਦਰੂਨੀ ਸੰਦਰਭ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾ ਸਕਦਾ ਹੈ;ਪੂਛ ਜੋੜਨ ਦਾ ਤਰੀਕਾ ਦੋ ਤੋਂ ਬਣਿਆ ਹੁੰਦਾ ਹੈ ਇਹ ਦੋ ਐਨਜ਼ਾਈਮਾਂ ਦੀ ਸੰਯੁਕਤ ਕਿਰਿਆ ਦੁਆਰਾ ਪੂਰਾ ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ ਪੋਲੀਏ ਪੋਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਅਤੇ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟੇਜ ਹਨ।ਪੋਲੀਏ ਪੋਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਇਸਦੀ ਲੰਬਾਈ ਨੂੰ ਵਧਾਉਣ ਲਈ ਪੋਲੀਏ ਟੇਲਾਂ ਨੂੰ miRNA ਵਿੱਚ ਜੋੜਨ ਲਈ ਜ਼ਿੰਮੇਵਾਰ ਹੈ, ਅਤੇ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟੇਸ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਕਰਦਾ ਹੈ।ਇਸ ਵਿਧੀ ਵਿੱਚ ਉੱਚ ਖੋਜ ਥ੍ਰੁਪੁੱਟ ਹੈ ਅਤੇ ਇੱਕ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਵਿੱਚ ਕਈ miRNAs ਅਤੇ ਅੰਦਰੂਨੀ ਸੰਦਰਭਾਂ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਪਰ ਸਟੈਮ-ਲੂਪ ਵਿਧੀ ਵਿੱਚ ਸੰਵੇਦਨਸ਼ੀਲਤਾ ਅਤੇ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਘੱਟ ਹੈ।