RT-qPCR ਪ੍ਰਯੋਗ ਵਿੱਚ RNA ਕੱਢਣ ਅਤੇ ਗੁਣਵੱਤਾ ਦਾ ਮੁਲਾਂਕਣ, ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਅਤੇ qPCR ਤਿੰਨ ਪੜਾਅ ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ, ਹਰੇਕ ਪੜਾਅ ਵਿੱਚ ਬਹੁਤ ਸਾਰੀਆਂ ਸਾਵਧਾਨੀਆਂ ਹਨ, ਅਸੀਂ ਹੇਠਾਂ ਵਿਸਥਾਰ ਵਿੱਚ ਪੇਸ਼ ਕਰਾਂਗੇ।

ⅠRNA ਗੁਣਵੱਤਾ ਮੁਲਾਂਕਣ

RT-qPCR ਪ੍ਰਯੋਗ ਵਿੱਚ, RNA ਕੱਢਣ ਦੇ ਪੂਰਾ ਹੋਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, RNA ਦੀ ਗੁਣਵੱਤਾ ਦਾ ਮੁਲਾਂਕਣ ਕਰਨ ਦੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ, ਅਤੇ ਫਾਲੋ-ਅੱਪ ਪ੍ਰਯੋਗ ਕੇਵਲ ਇਸਦੇ ਯੋਗ ਹੋਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਹੀ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਮੁਲਾਂਕਣ ਵਿਧੀਆਂ ਵਿੱਚ ਸਪੈਕਟ੍ਰੋਫੋਟੋਮੀਟਰ, ਐਜਿਲੈਂਟ ਜੈੱਲ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਫੋਰੇਸਿਸ, ਐਜੀਲੈਂਟ 2100 ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ, ਜਿਨ੍ਹਾਂ ਵਿੱਚੋਂ ਸਭ ਤੋਂ ਵੱਧ ਵਰਤਿਆ ਜਾਣ ਵਾਲਾ ਸਪੈਕਟ੍ਰੋਫੋਟੋਮੀਟਰ ਅਤੇ ਐਗਰੋਸ ਜੈੱਲ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਫੋਰੇਸਿਸ ਵਿਧੀ ਖੋਜ।ਇਹ ਨੋਟ ਕੀਤਾ ਜਾਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ ਕਿ ਇਹਨਾਂ ਦੋ ਤਰੀਕਿਆਂ ਨੂੰ RNA ਦੀ ਇਕਾਗਰਤਾ, ਸ਼ੁੱਧਤਾ ਅਤੇ ਅਖੰਡਤਾ ਦੀ ਖੋਜ ਅਤੇ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੂੰ ਪੂਰਾ ਕਰਨ ਲਈ ਇਕੱਠੇ ਵਰਤਣ ਦੀ ਲੋੜ ਹੈ, ਤਾਂ ਜੋ RNA ਦੀ ਗੁਣਵੱਤਾ ਨੂੰ ਯਕੀਨੀ ਬਣਾਇਆ ਜਾ ਸਕੇ।

ਸੰਬੰਧਿਤ ਆਰਐਨਏ ਆਈਸੋਲੇਸ਼ਨ ਕਿੱਟ: 

ਸੈੱਲ ਕੁੱਲ RNA ਆਈਸੋਲੇਸ਼ਨ ਕਿੱਟ

11 ਮਿੰਟ ਵਿੱਚ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਸੰਸਕ੍ਰਿਤ ਸੈੱਲਾਂ ਤੋਂ ਉੱਚ ਪੱਧਰੀ ਸ਼ੁੱਧ ਅਤੇ ਉੱਚ-ਗੁਣਵੱਤਾ ਵਾਲਾ ਕੁੱਲ RNA ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।

ਜਾਨਵਰਾਂ ਦੀ ਕੁੱਲ RNA ਆਈਸੋਲੇਸ਼ਨ ਕਿੱਟ

ਵੱਖ-ਵੱਖ ਜਾਨਵਰਾਂ ਦੇ ਟਿਸ਼ੂਆਂ ਤੋਂ ਤੇਜ਼ੀ ਨਾਲ ਅਤੇ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਨਾਲ ਉੱਚ-ਸ਼ੁੱਧਤਾ ਅਤੇ ਉੱਚ-ਗੁਣਵੱਤਾ ਵਾਲੇ ਕੁੱਲ ਆਰ.ਐਨ.ਏ.

ਸਪੈਕਟ੍ਰੋਫੋਟੋਮੀਟਰ:

ਸਪੈਕਟ੍ਰੋਫੋਟੋਮੀਟਰ ਮੁੱਖ ਤੌਰ 'ਤੇ ਆਰਐਨਏ ਦੀ ਇਕਾਗਰਤਾ ਅਤੇ ਸ਼ੁੱਧਤਾ ਨੂੰ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨ ਲਈ ਵਰਤਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਪਰ ਇਹ ਆਰਐਨਏ ਅਤੇ ਜੀਨੋਮਿਕ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਦੀ ਇਕਸਾਰਤਾ ਦਾ ਪਤਾ ਨਹੀਂ ਲਗਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਉਹਨਾਂ ਵਿੱਚੋਂ, A260/280 ਅਤੇ A260/230 RNA ਸ਼ੁੱਧਤਾ ਖੋਜ ਲਈ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਮਾਪਦੰਡ ਹਨ, ਅਤੇ RNA ਸ਼ੁੱਧਤਾ ਨੂੰ ਉਹਨਾਂ ਦੇ ਮੁੱਲਾਂ ਦੇ ਉਤਰਾਅ-ਚੜ੍ਹਾਅ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ ਖੋਜਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ:

1. 1.9< A260/280< 2.1, ਇਹ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ RNA ਸ਼ੁੱਧਤਾ ਚੰਗੀ ਹੈ;A260/280<1.9, ਇਹ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ RNA ਵਿੱਚ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੀ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਹੋ ਸਕਦੀ ਹੈ;A260/280>2.1, RNA ਦੇ ਸੰਭਾਵੀ ਅੰਸ਼ਕ ਗਿਰਾਵਟ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ, ਜਿਸਦੀ ਅਗਰੋਜ਼ ਜੈੱਲ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਫੋਰੇਸਿਸ ਦੁਆਰਾ ਹੋਰ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕੀਤੀ ਜਾ ਸਕਦੀ ਹੈ।

2. 2.0< A260/230< 2.2, ਇਹ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ RNA ਸ਼ੁੱਧਤਾ ਚੰਗੀ ਹੈ;A260/230< 2.0, ਇਹ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ RNA ਵਿੱਚ ਜੈਵਿਕ ਰੀਐਜੈਂਟਸ ਦੀ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਹੋ ਸਕਦੀ ਹੈ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਫਿਨੋਲ, ਈਥਾਨੌਲ ਜਾਂ ਸ਼ੱਕਰ।

ਐਗਰੋਸ ਜੈੱਲ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਫੋਰੇਸਿਸ:

ਐਗਰੋਜ਼ ਜੈੱਲ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਫੋਰੇਸਿਸ ਪਰਖ RNA ਦੀ ਇਕਸਾਰਤਾ, ਜੀਨੋਮ ਅਤੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੀ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਪਰ RNA ਦੀ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਨੂੰ ਸਹੀ ਢੰਗ ਨਾਲ ਮਾਪ ਨਹੀਂ ਸਕਦਾ ਜਾਂ ਜੈਵਿਕ ਰੀਐਜੈਂਟਸ ਦੀ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਦਾ ਪਤਾ ਨਹੀਂ ਲਗਾ ਸਕਦਾ।ਉਦਾਹਰਨ ਲਈ ਯੂਕੇਰੀਓਟਿਕ ਆਰਐਨਏ ਟੈਂਪਲੇਟਸ ਲਓ:

1. ਆਰਐਨਏ ਨੂੰ ਐਗਰੋਸ ਜੈੱਲ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਫੋਰੇਸਿਸ ਦੇ ਅਧੀਨ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਜੇ ਜੈੱਲ ਨਕਸ਼ੇ 'ਤੇ 28sRNA, 18sRNA ਅਤੇ 5.8sRNA ਦੇ ਸਿਰਫ਼ ਤਿੰਨ ਸਿੰਗਲ ਬੈਂਡ ਸਨ, ਤਾਂ ਇਹ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਕੱਢਿਆ ਗਿਆ RNA ਬਰਕਰਾਰ ਹੈ।ਜੇ ਕੋਈ ਖਿੱਚਣ ਵਾਲਾ ਵਰਤਾਰਾ ਹੈ, ਤਾਂ ਇਹ ਆਰਐਨਏ ਦੇ ਅੰਸ਼ਕ ਵਿਗੜਨ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ.

2. ਜੇਕਰ ਗੂੰਦ ਦੇ ਮੋਰੀ ਅਤੇ 28sRNA ਬੈਂਡ ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਇੱਕ ਸਿੰਗਲ ਚਮਕਦਾਰ ਬੈਂਡ ਹੈ, ਤਾਂ ਜੀਨੋਮਿਕ DNA ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਹੋ ਸਕਦੀ ਹੈ।

3. ਜੇਕਰ ਗੂੰਦ ਦੇ ਮੋਰੀ ਵਿੱਚ ਬੈਂਡ ਦਿਖਾਈ ਦਿੰਦੇ ਹਨ, ਤਾਂ ਇਹ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਅਤੇ ਹੋਰ ਮੈਕਰੋਮੋਲੀਕਿਊਲਰ ਪਦਾਰਥਾਂ ਦੀ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਹੋ ਸਕਦੀ ਹੈ।

Ⅱ. ਉਲਟਾ ਪ੍ਰਤੀਲਿਪੀ

ਆਰਐਨਏ ਕੱਢਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਇਸ ਨੂੰ ਅਗਲੇ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਲਈ cDNA ਵਿੱਚ ਉਲਟਾਉਣ ਦੀ ਲੋੜ ਹੈ, ਇਸਲਈ ਉਲਟਾ ਕਦਮ ਜ਼ਰੂਰੀ ਹੈ।ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਨੂੰ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟੇਜ ਅਤੇ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਦੀ ਚੋਣ ਤੋਂ ਪੇਸ਼ ਕੀਤਾ ਜਾਵੇਗਾ:

ਉਲਟਾ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟਸ ਚੋਣ:

ਆਮ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟਸ ਵਿੱਚ AMV RTase ਅਤੇ MMLV RTase ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ।AMV RTase ਦੇ RNase H ਵਿੱਚ ਮਜ਼ਬੂਤ ​​ਗਤੀਵਿਧੀ, ਛੋਟੀ ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਲੰਬਾਈ, ਘੱਟ ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਮਾਤਰਾ ਅਤੇ ਚੰਗੀ ਥਰਮਲ ਸਥਿਰਤਾ (42 ~ 55℃) ਹੈ।MMLV RTase ਦੀ RNase H ਗਤੀਵਿਧੀ ਕਮਜ਼ੋਰ ਹੈ, ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਦੀ ਲੰਬਾਈ ਲੰਮੀ ਹੈ, ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਵੱਧ ਹੈ, ਅਤੇ ਥਰਮਲ ਸਥਿਰਤਾ ਮਾੜੀ ਹੈ (37 ~ 42℃).

ਕਿਉਂਕਿ RNase H ਐਨਜ਼ਾਈਮ ਵਿੱਚ ਆਰਐਨਏ ਟੈਂਪਲੇਟ ਨੂੰ ਡੀਗਰੇਡ ਕਰਨ ਦਾ ਕੰਮ ਹੈ, ਕਮਜ਼ੋਰ RNase H ਗਤੀਵਿਧੀ ਦੇ ਨਾਲ MMLV ਨੂੰ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਦੇ ਦੌਰਾਨ ਤਰਜੀਹੀ ਤੌਰ 'ਤੇ ਚੁਣਿਆ ਜਾਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਬਾਅਦ ਵਿੱਚ ਜੈਨੇਟਿਕ ਇੰਜੀਨੀਅਰਿੰਗ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, MMLV ਦੀ ਥਰਮਲ ਸਥਿਰਤਾ ਇੱਕ ਗੁਣਾਤਮਕ ਲੀਪ ਤੱਕ ਪਹੁੰਚ ਗਈ ਹੈ।ਫੋਰਜੀਨ ਲੈਣਾਫੋਰਸੀ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟੇਸ (ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਲਈ M-MLV) ਇੱਕ ਉਦਾਹਰਨ ਦੇ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਇਹ ਜੈਨੇਟਿਕ ਰੀਕੌਂਬੀਨੇਸ਼ਨ ਤਕਨਾਲੋਜੀ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਈ. ਕੋਲੀ ਇੰਜਨੀਅਰਡ ਬੈਕਟੀਰੀਆ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਗਟਾਇਆ ਗਿਆ ਇੱਕ ਨਵਾਂ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟੇਜ ਹੈ।ਇਹ ਇੱਕ ਰੀਕੌਂਬੀਨੈਂਟ ਡੀਐਨਏ ਪੋਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਹੈ ਜੋ ਸਿੰਗਲ-ਸਟ੍ਰੈਂਡਡ ਆਰਐਨਏ, ਡੀਐਨਏ, ਜਾਂ ਇੱਕ ਆਰਐਨਏ: ਡੀਐਨਏ ਹਾਈਬ੍ਰਿਡ ਤੋਂ ਇੱਕ ਪੂਰਕ ਡੀਐਨਏ ਸਟ੍ਰੈਂਡ ਦਾ ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਕਰਦਾ ਹੈ।ਇਸ ਵਿੱਚ ਕੋਈ RNase H ਗਤੀਵਿਧੀ, ਮਜ਼ਬੂਤ ​​ਸਥਿਰਤਾ, ਮਜ਼ਬੂਤ ​​RNA ਸਬੰਧ, ਅਤੇ ਉੱਚ ਖੋਜ ਸੰਵੇਦਨਸ਼ੀਲਤਾ ਨਹੀਂ ਹੈ।

 

ਫੋਰਸੀ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟੇਸ (ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਲਈ M-MLV)

ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਦੀ ਚੋਣ:

ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ RT ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਤਿੰਨ ਸ਼੍ਰੇਣੀਆਂ ਵਿੱਚ ਆਉਂਦੇ ਹਨ: ਓਲੀਗੋ ਡੀਟੀ, ਬੇਤਰਤੀਬ ਪ੍ਰਾਈਮਰ, ਅਤੇ ਜੀਨ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਪ੍ਰਾਈਮਰ।ਵੱਖ-ਵੱਖ ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਲੋੜਾਂ ਅਨੁਸਾਰ ਵਰਤੋਂ ਲਈ ਢੁਕਵੇਂ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਚੁਣੋ।

1. ਜੇਕਰ ਟੈਂਪਲੇਟ ਯੂਕੇਰੀਓਟਿਕ ਮੂਲ ਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਦੇਰ ਨਾਲ cDNA ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਰੁਟੀਨ ਪੀਸੀਆਰ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਲਈ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ, ਓਲੀਗੋ (ਡੀਟੀ) ਦੀ ਸਿਫਾਰਸ਼ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ;ਜੇਕਰ ਬਾਅਦ ਦੇ ਪ੍ਰਯੋਗ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਸਿਰਫ qPCR ਲਈ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ, ਤਾਂ ਉਲਟਾ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਦੀ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਨੂੰ ਬਿਹਤਰ ਬਣਾਉਣ ਲਈ ਓਲੀਗੋ (dT) ਨੂੰ ਬੇਤਰਤੀਬ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਨਾਲ ਮਿਲਾਉਣ ਦੀ ਸਿਫਾਰਸ਼ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ।

2. ਜੇਕਰ ਟੈਂਪਲੇਟ ਪ੍ਰੋਕੈਰੀਓਟਸ ਤੋਂ ਹੈ, ਤਾਂ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਲਈ ਰੈਂਡਮ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਜਾਂ ਜੀਨ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਚੁਣੇ ਜਾਣੇ ਚਾਹੀਦੇ ਹਨ।

Ⅲ.qPCR

ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਮਾਤਰਾਕਰਨ ਮੁੱਖ ਤੌਰ 'ਤੇ ਮਾਤਰਾਤਮਕ ਤਰੀਕਿਆਂ ਦੀ ਚੋਣ, ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਸਿਧਾਂਤ, ROX ਚੋਣ, ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਪ੍ਰਣਾਲੀ ਦੀ ਸੰਰਚਨਾ ਅਤੇ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਸਥਿਤੀਆਂ ਸੈਟਿੰਗਾਂ ਆਦਿ ਤੋਂ ਵਿਸਤ੍ਰਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ।

ਮਾਤਰਾਤਮਕ ਤਰੀਕਿਆਂ ਦੀ ਚੋਣ:

ਮਾਤਰਾਤਮਕ ਵਿਧੀਆਂ ਨੂੰ ਸਾਪੇਖਿਕ ਮਾਤਰਾਤਮਕ ਤਰੀਕਿਆਂ ਅਤੇ ਸੰਪੂਰਨ ਮਾਤਰਾਤਮਕ ਤਰੀਕਿਆਂ ਵਿੱਚ ਵੰਡਿਆ ਗਿਆ ਹੈ।ਜੀਨ ਸਮੀਕਰਨ 'ਤੇ ਕੁਝ ਇਲਾਜ ਵਿਧੀਆਂ ਦੇ ਪ੍ਰਭਾਵ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾਉਣ ਲਈ, ਵੱਖ-ਵੱਖ ਸਮਿਆਂ 'ਤੇ ਜੀਨ ਸਮੀਕਰਨ ਦੇ ਅੰਤਰ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾਉਣ ਅਤੇ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਟਿਸ਼ੂਆਂ ਵਿੱਚ ਜੀਨ ਸਮੀਕਰਨ ਦੇ ਅੰਤਰ ਦੀ ਤੁਲਨਾ ਕਰਨ ਲਈ ਸੰਬੰਧਿਤ ਮਾਤਰਾ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਜਾ ਸਕਦੀ ਹੈ।ਸੰਪੂਰਨ ਮਾਤਰਾ ਵਾਇਰਸ ਵਿੱਚ ਨਿਊਕਲੀਕ ਐਸਿਡ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾ ਸਕਦੀ ਹੈ ਅਤੇ ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ ਹੀ।ਪ੍ਰਯੋਗ ਕਰਦੇ ਸਮੇਂ, ਸਾਨੂੰ ਆਪਣੇ ਖੁਦ ਦੇ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ ਉਚਿਤ ਮਾਤਰਾਤਮਕ ਢੰਗਾਂ ਦੀ ਚੋਣ ਕਰਨੀ ਚਾਹੀਦੀ ਹੈ।

ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਦੇ ਸਿਧਾਂਤ:

qPCR ਲਈ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਦਾ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਸਿੱਧੇ ਤੌਰ 'ਤੇ ਐਂਪਲੀਫੀਕੇਸ਼ਨ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਅਤੇ ਉਤਪਾਦ ਦੀ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਨਾਲ ਸਬੰਧਤ ਹੈ।ਇਸ ਲਈ, ਚੰਗੇ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਨੂੰ ਸਹੀ ਢੰਗ ਨਾਲ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਕਰਨਾ ਸਫਲ qPCR ਦਾ ਪਹਿਲਾ ਕਦਮ ਹੈ।ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਦੇ ਡਿਜ਼ਾਇਨ ਵਿੱਚ, ਰਵਾਇਤੀ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਦੇ ਸਿਧਾਂਤ ਨੂੰ ਪੂਰਾ ਕਰਦੇ ਸਮੇਂ ਹੇਠਾਂ ਦਿੱਤੇ ਸਿਧਾਂਤਾਂ ਵੱਲ ਧਿਆਨ ਦਿੱਤਾ ਜਾਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ:

1. ਟੀਚੇ ਦੇ ਟੁਕੜੇ ਦੀ ਲੰਬਾਈ 100 ਅਤੇ 300 ਬੀਪੀ ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਨਿਯੰਤਰਿਤ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ;

2. ਜੀਨੋਮਿਕ ਡੀਐਨਏ ਦੇ ਪ੍ਰਭਾਵ ਤੋਂ ਬਚਣ ਲਈ ਕਰਾਸ-ਐਕਸੋਨ ਡਿਜ਼ਾਈਨ;

3. ਡਿਜ਼ਾਇਨ ਕੀਤੇ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਨੂੰ ਐਂਪਲੀਫੀਕੇਸ਼ਨ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਲਈ ਟੈਸਟ ਕੀਤੇ ਜਾਣ ਦੀ ਲੋੜ ਹੈ, ਅਤੇ ਕੇਵਲ ਜਦੋਂ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਮਿਆਰੀ (90-110%) ਤੱਕ ਪਹੁੰਚ ਜਾਂਦੀ ਹੈ ਤਾਂ ਉਹਨਾਂ ਨੂੰ ਮਾਤਰਾਤਮਕ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਲਈ ਵਰਤਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ;

4. ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ 0.1uM ਅਤੇ 1.0uM ਵਿਚਕਾਰ ਅਨੁਕੂਲਿਤ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।

ਦੀ ਚੋਣROX:

ਮਾਤਰਾਤਮਕ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਦੀ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਵਿੱਚ, ROX ਆਪਟੀਕਲ ਪਾਥ ਫਰਕ, ਪਾਈਪਟਿੰਗ ਗਲਤੀ ਜਾਂ ਵਾਸ਼ਪੀਕਰਨ ਅਤੇ ਸੰਘਣਾਪਣ ਦੇ ਕਾਰਨ ਵਾਲੀਅਮ ਫਰਕ ਨੂੰ ਇੱਕਸਾਰ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਅਨੁਕੂਲ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਨਤੀਜਿਆਂ ਦੀ ਦੁਹਰਾਉਣਯੋਗਤਾ ਵਿੱਚ ਸੁਧਾਰ ਕਰਦਾ ਹੈ।ਹਾਲਾਂਕਿ, ਇਹ ਨੋਟ ਕੀਤਾ ਜਾਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ ਕਿ ROX ਦੀ ਚੋਣ ਸਾਧਨ ਨਾਲ ਸਬੰਧਤ ਹੈ.ਜੇਕਰ qPCR ਯੰਤਰ ਵਿੱਚ ਛੇਕਾਂ ਵਿਚਕਾਰ ਅੰਤਰ ਨੂੰ ਆਪਣੇ ਆਪ ਠੀਕ ਕਰਨ ਦਾ ਕੰਮ ਹੈ, ਤਾਂ ਇਸਨੂੰ ROX ਜੋੜਨ ਦੀ ਲੋੜ ਨਹੀਂ ਹੈ;ਨਹੀਂ ਤਾਂ, ਇਸਨੂੰ ROX ਸੁਧਾਰ ਜੋੜਨ ਦੀ ਲੋੜ ਹੈ।ਰੀਐਜੈਂਟਸ ਖਰੀਦਣ ਵਿੱਚ ਛੋਟੇ ਭਾਈਵਾਲਾਂ ਨੂੰ ਸਹੀ ROX ਦੀ ਚੋਣ ਕਰਨ ਲਈ ਵਰਤੇ ਗਏ ਸਾਧਨ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ ਹੋਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ, ਬਾਅਦ ਵਿੱਚ ਗਲਤੀਆਂ ਤੋਂ ਬਚੋ।

ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਪ੍ਰਣਾਲੀ ਦੀ ਤਿਆਰੀ:

20ul ਅਤੇ 50ul ਦੇ ਪ੍ਰਤੀਕਰਮ ਵਾਲੀਅਮ ਨੂੰ ਤਰਜੀਹ ਦਿੱਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ।ਜਦੋਂ ਸਿਸਟਮ ਤਿਆਰ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਤਾਂ ਹੇਠਾਂ ਦਿੱਤੇ ਮਾਮਲਿਆਂ ਵੱਲ ਧਿਆਨ ਦਿੱਤਾ ਜਾਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ:

1. ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਪ੍ਰਣਾਲੀ ਨੂੰ ਅਤਿ-ਸਾਫ਼ ਵਰਕਬੈਂਚ ਵਿੱਚ ਹਵਾਦਾਰੀ ਦੁਆਰਾ ਤਿਆਰ ਕਰਨ ਦੀ ਲੋੜ ਹੈ, ਨਵੀਂ ਡੀ.ਡੀ.ਐਚ.₂O ਹਰ ਪ੍ਰਯੋਗ ਲਈ ਵਰਤਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ;

2. ਹਰੇਕ ਪ੍ਰਯੋਗ ਨੂੰ ਇਹ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕਰਨ ਲਈ NTC ਤਿਆਰ ਕਰਨ ਦੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ ਕਿ ਕੀ ਸਿਸਟਮ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਦੂਸ਼ਣ ਹੈ, ਅਤੇ ਸਿਸਟਮ ਨੂੰ ਤਿਆਰ ਕਰਨ ਵੇਲੇ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਦੇ ਹਰੇਕ ਜੋੜੇ ਨੂੰ NTC ਕਰਨ ਦੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ;

3. ਇਹ ਪਤਾ ਲਗਾਉਣ ਲਈ ਕਿ ਕੀ RNA ਟੈਂਪਲੇਟ ਵਿੱਚ gDNA ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਹੈ, ਖੋਜ ਲਈ ਹਰੇਕ ਨਮੂਨੇ ਲਈ NRT ਤਿਆਰ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ;

4. ਸਿਸਟਮ ਨੂੰ ਤਿਆਰ ਕਰਦੇ ਸਮੇਂ, ਇੱਕ ਨਮੂਨੇ ਲਈ ਘੱਟੋ ਘੱਟ 3 ਤਕਨੀਕੀ ਦੁਹਰਾਓ ਕਰਨ ਦੀ ਸਿਫਾਰਸ਼ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ;

5. ਜਦੋਂ ਟੈਂਪਲੇਟ cDNA ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਤਾਂ qPCR ਪ੍ਰਯੋਗ 'ਤੇ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਪ੍ਰਣਾਲੀ ਦੇ ਰੋਕ ਪ੍ਰਭਾਵ ਨੂੰ ਘਟਾਉਣ ਲਈ ਇਸਨੂੰ 5-10 ਵਾਰ ਪਤਲਾ ਕਰਨ ਦੀ ਸਿਫਾਰਸ਼ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ।ਗਰੇਡੀਐਂਟ ਦੁਆਰਾ ਟੈਂਪਲੇਟ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਦੀ ਪੜਚੋਲ ਕਰਨਾ ਬਿਹਤਰ ਹੈ, ਤਾਂ ਜੋ ਸੀਟੀ ਮੁੱਲ 20-30 ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਆ ਜਾਵੇ;

6. ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਦੀ ਲੋੜੀਂਦੀ ਗਿਣਤੀ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾਓ, ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਦੀ ਸੰਖਿਆ ਦੇ ਆਧਾਰ 'ਤੇ 5-10% ਦਾ ਵਾਧਾ ਕਰੋ, ਅਤੇ ਵਾਲੀਅਮ ਕੌਂਫਿਗਰੇਸ਼ਨ ਨੰਬਰ ਦੀ ਗਣਨਾ ਕਰੋ;

7, ਸਿਸਟਮ ਨੂੰ ਪ੍ਰੀਮਿਕਸ ਸਿਧਾਂਤ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਤਿਆਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ, ਸੈਂਟਰੀਫਿਊਗੇਸ਼ਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਮਿਲਾਇਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਇਹ ਯਕੀਨੀ ਬਣਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਕੋਈ ਬੁਲਬਲੇ ਨਹੀਂ ਹਨ;

8, ਜਿੱਥੋਂ ਤੱਕ ਸੰਭਵ ਹੋਵੇ ਸਹਾਇਕ ਖਪਤਕਾਰਾਂ ਦੀ ਚੋਣ ਕਰਨ ਲਈ.

ਸੰਬੰਧਿਤ RT-qPCR ਕਿੱਟ