ਖੋਜ ਦੀ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ
ਜ਼ਿਆਦਾਤਰ ਮਾਮਲਿਆਂ ਵਿੱਚ, ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਦਾ ਉਦੇਸ਼ ਪੀਸੀਆਰ ਦੀ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਨੂੰ ਵੱਧ ਤੋਂ ਵੱਧ ਕਰਨਾ ਹੈ।ਇਹ ਬਹੁਤ ਸਾਰੇ ਵੇਰੀਏਬਲਾਂ ਦੇ ਘੱਟ ਜਾਂ ਘੱਟ ਅਨੁਮਾਨਿਤ ਪ੍ਰਭਾਵ ਦੁਆਰਾ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਇੱਕ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਵੇਰੀਏਬਲ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਦੇ 3′ਅੰਤ 'ਤੇ ਕ੍ਰਮ ਹੈ।
ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਲਈ ਤਿਆਰ ਕੀਤੇ ਗਏ ਪੀਸੀਆਰ ਅਸੇਸ ਇੱਕ ਵਿਸ਼ਾਲ ਗਤੀਸ਼ੀਲ ਰੇਂਜ ਵਿੱਚ ਉੱਚ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਨੂੰ ਬਰਕਰਾਰ ਰੱਖਣ ਦੀ ਜ਼ਿਆਦਾ ਸੰਭਾਵਨਾ ਰੱਖਦੇ ਹਨ, ਕਿਉਂਕਿ ਪਰਖ ਗੈਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਐਂਪਲੀਫੀਕੇਸ਼ਨ ਉਤਪਾਦਾਂ ਦਾ ਉਤਪਾਦਨ ਨਹੀਂ ਕਰਦਾ, ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ ਪੀਸੀਆਰ ਰੀਐਜੈਂਟਸ ਨਾਲ ਮੁਕਾਬਲਾ ਕਰਦਾ ਹੈ ਜਾਂ ਮੁੱਖ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਨੂੰ ਰੋਕਦਾ ਹੈ।
ਬੇਸ਼ੱਕ, ਕੁਝ ਮਾਮਲਿਆਂ ਵਿੱਚ, ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਸਭ ਤੋਂ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਨਹੀਂ ਹੁੰਦੀ, ਉਦਾਹਰਨ ਲਈ, ਜਦੋਂ ਟੀਚਾ ਨੇੜਿਓਂ ਸਬੰਧਤ ਪਰ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਰੋਗਾਣੂਆਂ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨਾ ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਡਿਜ਼ਾਈਨ, ਅਨੁਕੂਲਤਾ ਅਤੇ ਤਸਦੀਕ ਮਾਪਦੰਡਾਂ ਦੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ।
ਪਿਘਲਣ ਵਾਲੀ ਕਰਵ ਐਂਪਲੀਕਨਾਂ ਦੀ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਦਾ ਮੁਲਾਂਕਣ ਕਰਨ ਲਈ ਇੱਕ ਮਿਆਰੀ ਵਿਧੀ ਹੈ, ਘੱਟੋ ਘੱਟ ਇਸ ਗੱਲ ਵਿੱਚ ਕਿ ਕੀ ਇੱਕ ਸਿੰਗਲ ਟੀਚੇ ਨੂੰ ਵਧਾਉਣਾ ਹੈ।ਹਾਲਾਂਕਿ, ਇਸ ਗੱਲ 'ਤੇ ਜ਼ੋਰ ਦਿੱਤਾ ਜਾਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ ਕਿ ਪਿਘਲਣ ਵਾਲੇ ਕਰਵ ਗੁੰਮਰਾਹਕੁੰਨ ਹੋ ਸਕਦੇ ਹਨ ਕਿਉਂਕਿ, ਉਦਾਹਰਨ ਲਈ, ਉਹ ਸਬਓਪਟੀਮਲ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਅਤੇ ਘੱਟ ਟੈਂਪਲੇਟ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਦੇ ਸੰਯੁਕਤ ਪ੍ਰਭਾਵਾਂ ਦੁਆਰਾ ਪ੍ਰਭਾਵਿਤ ਹੋ ਸਕਦੇ ਹਨ।
P5 |ਪਿਘਲਣ ਵਾਲਾ ਵਕਰ ਦੋ ਨਿਸ਼ਾਨਾ ਡੀਐਨਏ ਦੀਆਂ ਵੱਖੋ ਵੱਖਰੀਆਂ ਮਾਤਰਾਵਾਂ ਦੀਆਂ ਦੋ ਖੋਜਾਂ ਤੋਂ ਪ੍ਰਾਪਤ ਟੀਐਮ ਸ਼ਿਫਟਾਂ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ।
A. ਉੱਚ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ (ad) 'ਤੇ, qPCR ਮਾਪ ਪੂਰਾ ਹੋਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਕੋਈ ਸਪੱਸ਼ਟ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਡਾਇਮਰ ਨਹੀਂ ਹੁੰਦਾ ਹੈ।ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਟੈਂਪਲੇਟ ਇਕਾਗਰਤਾ 50 ਕਾਪੀਆਂ (e) ਤੱਕ ਘੱਟ ਜਾਂਦੀ ਹੈ, ਇੱਕ ਗੈਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਉਤਪਾਦ ਦਿਖਾਈ ਦੇਣਾ ਸ਼ੁਰੂ ਹੋ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਸਭ ਤੋਂ ਘੱਟ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ (f) 'ਤੇ ਇਕੋ ਉਤਪਾਦ ਬਣ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।
B. ਟੈਸਟ ਨੇ ਸਾਰੇ ਟੀਚੇ ਦੀ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ 'ਤੇ ਇੱਕੋ ਜਿਹੇ Tms ਨੂੰ ਰਿਕਾਰਡ ਕੀਤਾ, ਅਤੇ ਸਭ ਤੋਂ ਘੱਟ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ (5 ਕਾਪੀਆਂ) 'ਤੇ ਵੀ ਕੋਈ ਸਪੱਸ਼ਟ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਡਾਇਮਰ ਨਹੀਂ ਸੀ।ਇਹਨਾਂ ਦੋ ਖੋਜ ਵਿਧੀਆਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਸਮੇਂ, NTCs ਵਿੱਚ ਕੋਈ ਵੀ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਉਤਪਾਦ ਨਹੀਂ ਲੱਭੇ ਗਏ ਸਨ।
P5 ਨਮੂਨਿਆਂ ਦੇ ਨਾਲ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੇ ਭੰਗ ਵਕਰਾਂ ਨੂੰ ਦਿਖਾਉਂਦਾ ਹੈ ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਟੈਂਪਲੇਟ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਸੰਘਣਤਾਵਾਂ 'ਤੇ ਮੌਜੂਦ ਹੁੰਦਾ ਹੈ।P 5a ਦਿਖਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਦੋ ਸਭ ਤੋਂ ਘੱਟ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ 'ਤੇ, ਪੈਦਾ ਕੀਤੇ ਗੈਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਐਂਪਲੀਕੇਸ਼ਨ ਉਤਪਾਦਾਂ ਦੇ Tms ਖਾਸ ਐਂਪਲੀਕਨਾਂ ਨਾਲੋਂ ਘੱਟ ਹਨ।
ਸਪੱਸ਼ਟ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਇਸ ਖੋਜ ਵਿਧੀ ਨੂੰ ਘੱਟ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਵਿੱਚ ਮੌਜੂਦ ਟੀਚਿਆਂ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾਉਣ ਲਈ ਭਰੋਸੇਯੋਗ ਢੰਗ ਨਾਲ ਨਹੀਂ ਵਰਤਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ।
ਦਿਲਚਸਪ ਗੱਲ ਇਹ ਹੈ ਕਿ, NTCs, ਭਾਵ, ਬਿਨਾਂ ਕਿਸੇ DNA ਵਾਲੇ ਨਮੂਨੇ, (ਗੈਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼) ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਉਤਪਾਦਾਂ ਨੂੰ ਰਿਕਾਰਡ ਨਹੀਂ ਕਰਦੇ, ਇਹ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ ਕਿ ਬੈਕਗ੍ਰਾਉਂਡ ਜੀਨੋਮਿਕ ਡੀਐਨਏ ਗੈਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ/ਪੋਲੀਮਰਾਈਜ਼ੇਸ਼ਨ ਵਿੱਚ ਹਿੱਸਾ ਲੈ ਸਕਦਾ ਹੈ।
ਕਈ ਵਾਰ ਅਜਿਹੇ ਬੈਕਗ੍ਰਾਉਂਡ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਅਤੇ ਗੈਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਨੂੰ ਠੀਕ ਨਹੀਂ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਪਰ ਅਕਸਰ ਇੱਕ ਖੋਜ ਵਿਧੀ ਨੂੰ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਕਰਨਾ ਸੰਭਵ ਹੁੰਦਾ ਹੈ ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਕਿਸੇ ਵੀ ਟੈਂਪਲੇਟ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਅਤੇ NTC (P 5b) ਵਿੱਚ ਗੈਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਨਹੀਂ ਹੁੰਦਾ ਹੈ।
ਇੱਥੇ, 35 ਦੇ ਇੱਕ Cq ਨਾਲ ਟੀਚੇ ਦੀ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਨੂੰ ਵੀ ਰਿਕਾਰਡ ਕਰਨਾ ਇੱਕ ਖਾਸ ਭੰਗ ਵਕਰ ਪੈਦਾ ਕਰੇਗਾ।ਇਸੇ ਤਰ੍ਹਾਂ, NTCs ਨੇ ਗੈਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਵਾਧਾ ਦੇ ਕੋਈ ਸੰਕੇਤ ਨਹੀਂ ਦਿਖਾਏ।ਕਦੇ-ਕਦਾਈਂ, ਖੋਜ ਦਾ ਵਿਵਹਾਰ ਮਾਂ ਦੀ ਸ਼ਰਾਬ 'ਤੇ ਨਿਰਭਰ ਹੋ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਕੁਝ ਖਾਸ ਬਫਰ ਰਚਨਾਵਾਂ ਵਿੱਚ ਸਿਰਫ ਗੈਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਖੋਜਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ ਵੱਖ-ਵੱਖ Mg2+ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਨਾਲ ਸੰਬੰਧਿਤ ਹੋ ਸਕਦਾ ਹੈ।
ਖੋਜ ਦੀ ਸਥਿਰਤਾ
Ta ਦਾ ਅਨੁਕੂਲਨ qPCR ਖੋਜ ਦੀ ਅਨੁਭਵੀ ਤਸਦੀਕ ਅਤੇ ਅਨੁਕੂਲਨ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਉਪਯੋਗੀ ਕਦਮ ਹੈ।ਇਹ ਤਾਪਮਾਨ (ਜਾਂ ਤਾਪਮਾਨ ਰੇਂਜ) ਦਿਖਾ ਕੇ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਸੈੱਟ ਦੀ ਮਜ਼ਬੂਤੀ ਦਾ ਸਿੱਧਾ ਸੰਕੇਤ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰਦਾ ਹੈ ਜੋ NTC ਨੂੰ ਵਧਾਏ ਬਿਨਾਂ ਸਭ ਤੋਂ ਘੱਟ Cq ਪੈਦਾ ਕਰਦਾ ਹੈ।
ਸੰਵੇਦਨਸ਼ੀਲਤਾ ਵਿੱਚ ਦੋ ਤੋਂ ਚਾਰ ਗੁਣਾ ਅੰਤਰ ਉੱਚ mRNA ਸਮੀਕਰਨ ਵਾਲੇ ਲੋਕਾਂ ਲਈ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਨਹੀਂ ਹੋ ਸਕਦਾ, ਪਰ ਡਾਇਗਨੌਸਟਿਕ ਟੈਸਟਾਂ ਲਈ, ਇਸਦਾ ਮਤਲਬ ਸਕਾਰਾਤਮਕ ਅਤੇ ਗਲਤ ਨਕਾਰਾਤਮਕ ਨਤੀਜਿਆਂ ਵਿੱਚ ਅੰਤਰ ਹੋ ਸਕਦਾ ਹੈ।
QPCR ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਦੀਆਂ Ta ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾਵਾਂ ਬਹੁਤ ਵੱਖਰੀਆਂ ਹੋ ਸਕਦੀਆਂ ਹਨ।ਕੁਝ ਟੈਸਟ ਬਹੁਤ ਮਜਬੂਤ ਨਹੀਂ ਹੁੰਦੇ ਹਨ, ਅਤੇ ਜੇਕਰ ਉਹ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਦੇ ਅਨੁਕੂਲ Ta ਮੁੱਲ ਦੇ ਅਧੀਨ ਨਹੀਂ ਕੀਤੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ, ਤਾਂ ਉਹ ਜਲਦੀ ਹੀ ਢਹਿ ਜਾਣਗੇ।
ਇਹ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਹੈ ਕਿਉਂਕਿ ਅਸਲ ਸੰਸਾਰ ਵਿੱਚ ਇਸ ਕਿਸਮ ਦੀ ਖੋਜ ਅਕਸਰ ਸਮੱਸਿਆ ਵਾਲੀ ਹੁੰਦੀ ਹੈ, ਅਤੇ ਨਮੂਨੇ ਦੀ ਸ਼ੁੱਧਤਾ, ਡੀਐਨਏ ਦੀ ਇਕਾਗਰਤਾ, ਜਾਂ ਦੂਜੇ ਡੀਐਨਏ ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਅਨੁਕੂਲ ਨਹੀਂ ਹੋ ਸਕਦੀ ਹੈ।
ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਟਾਰਗੇਟ ਕਾਪੀ ਨੰਬਰ ਇੱਕ ਵਿਸ਼ਾਲ ਸ਼੍ਰੇਣੀ ਵਿੱਚ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਹੋ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਰੀਐਜੈਂਟਸ, ਪਲਾਸਟਿਕ ਦੇ ਭਾਂਡੇ, ਜਾਂ ਯੰਤਰ ਟੈਸਟ ਸਥਾਪਤ ਕਰਨ ਵੇਲੇ ਵਰਤੇ ਜਾਣ ਵਾਲੇ ਸਾਧਨਾਂ ਨਾਲੋਂ ਵੱਖਰੇ ਹੋ ਸਕਦੇ ਹਨ।
P6|ਤਾਪਮਾਨ ਗਰੇਡੀਏਂਟ ਪੀਸੀਆਰ ਖੋਜ ਦੀ ਵੱਖਰੀ ਮਜ਼ਬੂਤੀ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ।
A. ਮਨੁੱਖੀ ਦਿਮਾਗ ਦੇ RNA ਤੋਂ ਤਿਆਰ cDNA 'ਤੇ PCR ਕਰਨ ਲਈ Bioline ਦੇ Sensifast SYBR ਮਾਸਟਰਮਿਕਸ (ਕੈਟਲਾਗ ਨੰਬਰ BIO-98050) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ।
B. ਐਪਲੀਨ (NM_033207, F: GCCATGGAGGAAAAGTGACAGACC, R: CTCATGTGTGTGGTGATCTCCTAGG) ਦੇ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਮੈਪ ਅਤੇ ਭੰਗ ਕਰਵ ਨੂੰ ਰਿਕਾਰਡ ਕਰਨ ਲਈ ਬਾਇਓ-ਰੈਡ ਦੇ CFX qPCR ਯੰਤਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ।
C. ACSBG1 (NM_015162.4, F: CTACACTTCGGGCACCACTGG, R: GTCCACGTGATATTGTCTTGACTCAG) ਦਾ ਪ੍ਰਸਾਰਨ ਗ੍ਰਾਫ ਅਤੇ ਪਿਘਲਣ ਵਾਲਾ ਵਕਰ।
D. GFAP (NM_002055.5, F: TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG, R: CGAACCTCCTCTCGTGGATCTTC) ਦਾ ਪ੍ਰਸਾਰਨ ਗ੍ਰਾਫ ਅਤੇ ਭੰਗ ਕਰਵ।
E. ਵੱਖ-ਵੱਖ ਐਨੀਲਿੰਗ ਤਾਪਮਾਨਾਂ 'ਤੇ ਰਿਕਾਰਡ ਕੀਤੇ ਗਏ Cqs, 7C ਤਾਪਮਾਨ ਗਰੇਡੀਐਂਟ ਦੇ ਤਹਿਤ ਰਿਕਾਰਡ ਕੀਤੇ Cq ਵਿੱਚ ਅੰਤਰ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ।
P 6 ਇੱਕ ਅਣਚਾਹੇ ਟੈਸਟ ਦਾ ਇੱਕ ਆਮ ਨਤੀਜਾ ਦਿਖਾਉਂਦਾ ਹੈ, ਜਿੱਥੇ qPCR ਨੂੰ 59C ਅਤੇ 67C (P 6a) ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਇੱਕ ਗਰੇਡੀਐਂਟ ਟੈਸ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਤਿੰਨ ਮਨੁੱਖੀ ਦਿਮਾਗ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਜੀਨਾਂ ਲਈ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।
ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਗ੍ਰਾਫ ਤੋਂ ਇਹ ਦੇਖਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ ਕਿ ਓਪਲੀਨ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਆਦਰਸ਼ ਤੋਂ ਬਹੁਤ ਦੂਰ ਹਨ ਕਿਉਂਕਿ ਉਹਨਾਂ ਦੀ ਅਨੁਕੂਲ Ta ਰੇਂਜ ਬਹੁਤ ਤੰਗ ਹੈ (ਚਿੱਤਰ 6b), ਯਾਨੀ, Cqs ਵਿਆਪਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਖਿੰਡੇ ਹੋਏ ਹਨ, ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ Cqs ਉਹਨਾਂ ਦੇ ਅਨੁਕੂਲ Cqs ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ ਬਹੁਤ ਘੱਟ ਹਨ।
ਇਹ ਖੋਜ ਵਿਧੀ ਅਸਥਿਰ ਹੈ ਅਤੇ ਸਬ-ਓਪਟੀਮਲ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਦੀ ਅਗਵਾਈ ਕਰ ਸਕਦੀ ਹੈ।ਇਸ ਲਈ, ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਦੇ ਇਸ ਜੋੜੇ ਨੂੰ ਦੁਬਾਰਾ ਡਿਜ਼ਾਇਨ ਕੀਤਾ ਜਾਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ.ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਪਿਘਲਣ ਵਾਲੀ ਕਰਵ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ (ਇਨਸੈੱਟ) ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਇਸ ਖੋਜ ਵਿਧੀ ਦੀ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਵੀ ਸਮੱਸਿਆ ਵਾਲੀ ਹੋ ਸਕਦੀ ਹੈ, ਕਿਉਂਕਿ ਹਰੇਕ Ta ਦੀ ਪਿਘਲਣ ਵਾਲੀ ਵਕਰ ਵੱਖਰੀ ਹੁੰਦੀ ਹੈ।
P 6c ਵਿੱਚ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ACSBG1 ਖੋਜ ਵਿਧੀ ਉਪਰੋਕਤ ਓਪਲੀਨ ਖੋਜ ਵਿਧੀ ਨਾਲੋਂ ਵਧੇਰੇ ਮਜ਼ਬੂਤ ਹੈ, ਪਰ ਇਹ ਅਜੇ ਵੀ ਆਦਰਸ਼ ਤੋਂ ਬਹੁਤ ਦੂਰ ਹੈ, ਅਤੇ ਸੰਭਾਵਨਾ ਹੈ ਕਿ ਇਸਨੂੰ ਸੁਧਾਰਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।
ਹਾਲਾਂਕਿ, ਅਸੀਂ ਇਸ ਗੱਲ 'ਤੇ ਜ਼ੋਰ ਦਿੰਦੇ ਹਾਂ ਕਿ ਮਜਬੂਤੀ ਅਤੇ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਵਿਚਕਾਰ ਕੋਈ ਜ਼ਰੂਰੀ ਸਬੰਧ ਨਹੀਂ ਹੈ, ਕਿਉਂਕਿ ਇਸ ਖੋਜ ਵਿਧੀ ਦੁਆਰਾ ਪੈਦਾ ਕੀਤੀ ਭੰਗ ਵਕਰ ਸਾਰੇ ਟਾਸ (ਇਨਸੈੱਟ) ਵਿੱਚ ਇੱਕੋ ਸਿਖਰ ਮੁੱਲ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੀ ਹੈ।
ਦੂਜੇ ਪਾਸੇ, ਮਜਬੂਤਤਾ ਟੈਸਟ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਸਹਿਣਸ਼ੀਲ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ Tas ਦੀ ਵਿਸ਼ਾਲ ਸ਼੍ਰੇਣੀ ਵਿੱਚ ਸਮਾਨ Cqs ਪੈਦਾ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ P 6d ਵਿੱਚ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ GFAP ਟੈਸਟ ਵਿੱਚ।
ਉਸੇ 8 ਡਿਗਰੀ ਸੈਲਸੀਅਸ ਰੇਂਜ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੇ Cqs ਵਿੱਚ ਅੰਤਰ 1 ਤੋਂ ਘੱਟ ਹੈ, ਅਤੇ ਭੰਗ ਕਰਵ (ਇਨਸੈੱਟ) ਇਸ ਤਾਪਮਾਨ ਸੀਮਾ ਵਿੱਚ ਖੋਜ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾਵਾਂ ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕਰਦਾ ਹੈ।ਇਹ ਧਿਆਨ ਦੇਣ ਯੋਗ ਹੈ ਕਿ ਗਣਨਾ ਕੀਤੀ ਗਈ Tas ਅਤੇ ਅਸਲ Ta ਸੀਮਾ ਬਹੁਤ ਵੱਖਰੀ ਹੋ ਸਕਦੀ ਹੈ।
ਖੋਜਕਰਤਾਵਾਂ ਨੂੰ ਕੁਸ਼ਲ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਕਰਨ ਵਿੱਚ ਮਦਦ ਕਰਨ ਲਈ ਬਹੁਤ ਸਾਰੇ ਦਿਸ਼ਾ-ਨਿਰਦੇਸ਼ ਬਣਾਏ ਗਏ ਹਨ, ਜਿਨ੍ਹਾਂ ਵਿੱਚੋਂ ਜ਼ਿਆਦਾਤਰ ਲੰਬੇ-ਸਥਾਪਿਤ ਨਿਯਮਾਂ 'ਤੇ ਆਧਾਰਿਤ ਹਨ ਅਤੇ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਦੇ 3′ਸਿਰੇ 'ਤੇ ਬਹੁਤ ਧਿਆਨ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਹੈ।ਅਕਸਰ 3' ਦੇ ਅੰਤ 'ਤੇ G ਜਾਂ C ਅਤੇ ਦੋ G ਜਾਂ C ਬੇਸ (GC ਕਲੈਂਪ) ਨੂੰ ਸ਼ਾਮਲ ਕਰਨ ਦੀ ਸਿਫਾਰਸ਼ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ, ਪਰ ਆਖਰੀ 5 ਬੇਸਾਂ ਵਿੱਚੋਂ ਦੋ ਤੋਂ ਵੱਧ ਨਹੀਂ।
ਅਭਿਆਸ ਵਿੱਚ, ਇਹ ਨਿਯਮ ਖੋਜਕਰਤਾਵਾਂ ਦਾ ਮਾਰਗਦਰਸ਼ਨ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹਨ, ਪਰ ਇਹ ਜ਼ਰੂਰੀ ਨਹੀਂ ਕਿ ਉਹ ਸਾਰੀਆਂ ਸਥਿਤੀਆਂ ਵਿੱਚ ਸਹੀ ਹੋਣ।
P7 |ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਦੇ 3′ਸਿਰੇ ਦਾ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਜਾਂ ਕੁਸ਼ਲਤਾ 'ਤੇ ਬਹੁਤ ਘੱਟ ਪ੍ਰਭਾਵ ਪੈਂਦਾ ਹੈ।
A. ਮਨੁੱਖੀ HIF-1α (NM_181054.2) ਜੀਨ ਲਈ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਦੀ ਸਥਿਤੀ।
B. ਛੇ ਟੈਸਟ ਆਈਟਮਾਂ ਨੂੰ ਵਧਾਉਣ ਲਈ Agilent Brilliant III SYBR ਗ੍ਰੀਨ ਮਦਰ ਸ਼ਰਾਬ (ਕੈਟ. ਨੰਬਰ 600882) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ।
C. ਬਾਇਓ-ਰੈਡ ਦੇ CFX qPCR ਯੰਤਰ ਅਤੇ 3′ਐਂਡ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਦੁਆਰਾ ਰਿਕਾਰਡ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਗ੍ਰਾਫ ਅਤੇ ਪਿਘਲਣ ਵਾਲਾ ਕਰਵ।NTCs ਨੂੰ ਲਾਲ ਰੰਗ ਵਿੱਚ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ।
D. ਹਰੇਕ ਟੈਸਟ ਆਈਟਮ ਦਾ Cqs ਰਿਕਾਰਡ
ਉਦਾਹਰਨ ਲਈ, P 7 ਵਿੱਚ ਨਤੀਜਾ 3′ਅੰਤ ਦੇ ਨਿਯਮ ਦਾ ਖੰਡਨ ਕਰਦਾ ਹੈ।ਸਾਰੇ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਮੂਲ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਇੱਕੋ ਜਿਹੇ ਨਤੀਜੇ ਪੈਦਾ ਕਰਦੇ ਹਨ, ਸਿਰਫ ਦੋ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਸੰਜੋਗਾਂ ਦੇ ਨਾਲ NTC ਵਿੱਚ ਗੈਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਪ੍ਰਸਾਰਣ ਦੀ ਅਗਵਾਈ ਕਰਦੇ ਹਨ।
ਹਾਲਾਂਕਿ, ਅਸੀਂ GC ਕਲਿੱਪ ਦੇ ਪ੍ਰਭਾਵ ਦਾ ਸਮਰਥਨ ਨਹੀਂ ਕਰ ਸਕਦੇ, ਕਿਉਂਕਿ ਇਸ ਸਥਿਤੀ ਵਿੱਚ, ਵੱਧ ਤੋਂ ਵੱਧ 30 ਅਧਾਰਾਂ ਵਜੋਂ A ਜਾਂ T ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਨ ਨਾਲ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਨਹੀਂ ਘਟਦੀ ਹੈ।
ਟੈਸਟ C, ਜਿੱਥੇ F ਪ੍ਰਾਈਮਰ GGCC ਵਿੱਚ ਖਤਮ ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਨੇ NTCs ਵਿੱਚ Cqs ਰਿਕਾਰਡ ਕੀਤੇ, ਜੋ ਇਹ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਕੋਈ 30-ਅੰਤ 'ਤੇ ਇਹਨਾਂ ਕ੍ਰਮਾਂ ਤੋਂ ਬਚਣਾ ਚਾਹ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਅਸੀਂ ਇਸ ਗੱਲ 'ਤੇ ਜ਼ੋਰ ਦਿੰਦੇ ਹਾਂ ਕਿ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਜੋੜੇ ਦੇ ਸਭ ਤੋਂ ਵਧੀਆ 3′ਅੰਤ ਕ੍ਰਮ ਨੂੰ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨ ਦਾ ਇੱਕੋ ਇੱਕ ਤਰੀਕਾ ਹੈ ਕੁਝ ਉਮੀਦਵਾਰ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਦਾ ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਮੁਲਾਂਕਣ ਕਰਨਾ।
ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਕੁਸ਼ਲਤਾ
ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਹਾਲਾਂਕਿ ਗੈਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਪੀਸੀਆਰ ਖੋਜ ਕਦੇ ਵੀ ਖਾਸ ਨਹੀਂ ਬਣ ਸਕਦੀ, ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਨੂੰ ਕਈ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਤਰੀਕਿਆਂ ਨਾਲ ਐਨਜ਼ਾਈਮ, ਮਦਰ ਲਿਕਰ, ਐਡਿਟਿਵਜ਼, ਅਤੇ ਸਾਈਕਲਿੰਗ ਸਥਿਤੀਆਂ ਨੂੰ ਬਦਲ ਕੇ ਐਡਜਸਟ ਅਤੇ ਵੱਧ ਤੋਂ ਵੱਧ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।
ਪੀਸੀਆਰ ਖੋਜ ਦੀ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਦਾ ਮੁਲਾਂਕਣ ਕਰਨ ਲਈ, ਟੀਚੇ ਵਾਲੇ ਨਿਊਕਲੀਕ ਐਸਿਡ ਤੋਂ 10 ਜਾਂ 5 ਗੁਣਾ ਸੀਰੀਅਲ ਡਿਲਿਊਸ਼ਨ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਨਾ ਸਭ ਤੋਂ ਵਧੀਆ ਹੈ, ਯਾਨੀ "ਸਟੈਂਡਰਡ ਕਰਵ ਵਿਧੀ"।
ਜੇ ਪੀਸੀਆਰ ਐਂਪਲੀਕਨ ਜਾਂ ਸਿੰਥੈਟਿਕ ਡੀਐਨਏ ਟੀਚਿਆਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਇੱਕ ਮਿਆਰੀ ਕਰਵ ਬਣਾਉਣ ਲਈ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ, ਤਾਂ ਇਹਨਾਂ ਟੀਚਿਆਂ ਦੇ ਸੀਰੀਅਲ ਡਿਲਿਊਸ਼ਨ ਨੂੰ ਬੈਕਗ੍ਰਾਉਂਡ ਡੀਐਨਏ (ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਜੀਨੋਮਿਕ ਡੀਐਨਏ) ਦੀ ਇੱਕ ਸਥਿਰ ਮਾਤਰਾ ਨਾਲ ਮਿਲਾਇਆ ਜਾਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ।
P8 |ਪੀਸੀਆਰ ਦੀ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਦਾ ਮੁਲਾਂਕਣ ਕਰਨ ਲਈ ਪਤਲਾ ਕਰਵ।
A. PCR ਅਤੇ ਪਿਘਲਣ ਵਾਲੀ ਕਰਵ ਸਥਿਤੀਆਂ ਲਈ HIF-1: F: AAGAACTTTTAGGCCGCTCA ਅਤੇ R: TGTCCTGTGGTGTGACTTGTCC ਅਤੇ Agilent's Brilliant III SYBR ਗ੍ਰੀਨ ਮਾਸਟਰਮਿਕਸ (ਕੈਟਲਾਗ ਨੰਬਰ 600882) ਲਈ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ।
B. 100 ng RNA ਨੂੰ ਉਲਟਾ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਾਈਬ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, 2 ਵਾਰ ਪਤਲਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਲੜੀਵਾਰ ਤੌਰ 'ਤੇ ਪੇਤਲੇ ਹੋਏ cDNA ਨਮੂਨਿਆਂ ਨੂੰ 5 ਵਾਰ 1 ng ਮਨੁੱਖੀ ਜੀਨੋਮਿਕ ਡੀਐਨਏ ਵਿੱਚ ਪੇਤਲਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਪਿਘਲਣ ਦੀ ਵਕਰ ਇਨਸੈੱਟ ਵਿੱਚ ਦਿਖਾਈ ਗਈ ਹੈ।
C. ਦੂਜੇ ਸੀਡੀਐਨਏ ਨਮੂਨੇ ਲਈ ਆਰਟੀ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ, ਪਤਲਾ, ਅਤੇ ਸੀਰੀਅਲ ਡਿਲਿਊਸ਼ਨ ਨੂੰ ਦੁਹਰਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਨਤੀਜੇ ਸਮਾਨ ਸਨ।
P 8 ਦੋ ਸਟੈਂਡਰਡ ਕਰਵ ਦਿਖਾਉਂਦਾ ਹੈ, ਦੋ ਵੱਖ-ਵੱਖ cDNA ਨਮੂਨਿਆਂ 'ਤੇ ਇੱਕੋ ਖੋਜ ਵਿਧੀ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ, ਨਤੀਜਾ ਉਹੀ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਹੈ, ਲਗਭਗ 100%, ਅਤੇ R2 ਮੁੱਲ ਵੀ ਸਮਾਨ ਹੈ, ਅਰਥਾਤ, ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਡੇਟਾ ਅਤੇ ਰਿਗਰੈਸ਼ਨ ਲਾਈਨ ਜਾਂ ਡੇਟਾ ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਫਿੱਟ ਦੀ ਡਿਗਰੀ ਜਾਂ ਰੇਖਿਕਤਾ ਦੀ ਡਿਗਰੀ।
ਦੋ ਮਿਆਰੀ ਕਰਵ ਤੁਲਨਾਤਮਕ ਹਨ, ਪਰ ਬਿਲਕੁਲ ਇੱਕੋ ਜਿਹੇ ਨਹੀਂ ਹਨ।ਜੇਕਰ ਉਦੇਸ਼ ਟੀਚੇ ਦੀ ਸਹੀ ਮਾਤਰਾ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨਾ ਹੈ, ਤਾਂ ਇਹ ਨੋਟ ਕੀਤਾ ਜਾਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ ਕਿ ਅਨਿਸ਼ਚਿਤਤਾ ਦੀ ਵਿਆਖਿਆ ਕੀਤੇ ਬਿਨਾਂ ਕਾਪੀ ਨੰਬਰ ਦੀ ਗਣਨਾ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰਨਾ ਅਸਵੀਕਾਰਨਯੋਗ ਹੈ।
P9 |ਇੱਕ ਮਿਆਰੀ ਵਕਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਮਾਪ ਨਾਲ ਸੰਬੰਧਿਤ ਮਾਪ ਅਨਿਸ਼ਚਿਤਤਾ.
A. PCR ਅਤੇ ਪਿਘਲਣ ਵਾਲੀ ਕਰਵ ਸਥਿਤੀਆਂ ਕਰਨ ਲਈ GAPDH (NM_002046) ਲਈ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ।F: ACAGTTGCCATGTAGACC ਅਤੇ R: TAACTGGTTGAGCACAGG ਅਤੇ ਬਾਇਓਲਾਈਨ ਦਾ ਸੈਂਸੀਫਾਸਟ SYBR ਮਾਸਟਰਮਿਕਸ (ਕੈਟਲਾਗ ਨੰਬਰ BIO-98050)।
B. ਬਾਇਓ-ਰੈਡ ਦੇ CFX qPCR ਯੰਤਰ ਨਾਲ ਦਰਜ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਚਾਰਟ, ਪਿਘਲਣ ਵਾਲਾ ਕਰਵ ਅਤੇ ਸਟੈਂਡਰਡ ਕਰਵ।
C. ਸਟੈਂਡਰਡ ਕਰਵ ਗ੍ਰਾਫ ਅਤੇ 95% ਵਿਸ਼ਵਾਸ ਅੰਤਰਾਲ (CI)।
D. ਪਤਲਾ ਕਰਵ ਤੋਂ ਪ੍ਰਾਪਤ ਤਿੰਨ Cq ਮੁੱਲਾਂ ਦਾ ਕਾਪੀ ਨੰਬਰ ਅਤੇ 95% ਵਿਸ਼ਵਾਸ ਅੰਤਰਾਲ।
P 9 ਦਿਖਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਇੱਕ ਅਨੁਕੂਲਿਤ ਟੈਸਟ ਲਈ, ਇੱਕ ਸਿੰਗਲ ਸਟੈਂਡਰਡ ਕਰਵ ਦੀ ਅੰਦਰੂਨੀ ਪਰਿਵਰਤਨਸ਼ੀਲਤਾ ਲਗਭਗ 2 ਗੁਣਾ (95% ਵਿਸ਼ਵਾਸ ਅੰਤਰਾਲ, ਘੱਟੋ ਘੱਟ ਤੋਂ ਵੱਧ ਤੋਂ ਵੱਧ) ਹੈ, ਜੋ ਕਿ ਸਭ ਤੋਂ ਛੋਟੀ ਪਰਿਵਰਤਨਸ਼ੀਲਤਾ ਹੋ ਸਕਦੀ ਹੈ ਜਿਸਦੀ ਉਮੀਦ ਕੀਤੀ ਜਾ ਸਕਦੀ ਹੈ।
ਸੰਬੰਧਿਤ ਉਤਪਾਦ:
ਐਨੀਮਲ ਟਿਸ਼ੂ ਡਾਇਰੈਕਟ ਪੀਸੀਆਰ ਕਿੱਟ
ਪੋਸਟ ਟਾਈਮ: ਸਤੰਬਰ-30-2021
