1. ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਸਮਝ

ਇਸ ਪੜਾਅ 'ਤੇ, ਸਾਨੂੰ ਕੁਝ ਧਾਰਨਾਵਾਂ ਅਤੇ ਪਰਿਭਾਸ਼ਾਵਾਂ ਨੂੰ ਸਮਝਣ ਦੀ ਜ਼ਰੂਰਤ ਹੈ, ਤਾਂ ਜੋ ਆਪਣੇ ਬਜ਼ੁਰਗਾਂ ਦੇ ਸਾਹਮਣੇ ਗਲਤੀਆਂ ਕਰਨ ਤੋਂ ਬਚਿਆ ਜਾ ਸਕੇ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ:

ਸਵਾਲ: RT-PCR, qPCR, ਰੀਅਲ-ਟਾਈਮ PCR, ਅਤੇ ਰੀਅਲ-ਟਾਈਮ RT-PCR ਵਿੱਚ ਕੀ ਅੰਤਰ ਹੈ?

ਜਵਾਬ: RT-PCR ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ PCR ਹੈ(ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਪੀਸੀਆਰ, ਆਰਟੀ-ਪੀਸੀਆਰ), ਜੋ ਕਿ ਪੋਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਚੇਨ ਰਿਐਕਸ਼ਨ (ਪੀਸੀਆਰ) ਦਾ ਇੱਕ ਵਿਆਪਕ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਵਰਤਿਆ ਜਾਣ ਵਾਲਾ ਰੂਪ ਹੈ।ਆਰਟੀ-ਪੀਸੀਆਰ ਵਿੱਚ, ਇੱਕ ਆਰਐਨਏ ਸਟ੍ਰੈਂਡ ਨੂੰ ਪੂਰਕ ਡੀਐਨਏ ਵਿੱਚ ਉਲਟਾ ਲਿਖਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਜਿਸਨੂੰ ਫਿਰ ਪੀਸੀਆਰ ਦੁਆਰਾ ਡੀਐਨਏ ਪ੍ਰਸਾਰਣ ਲਈ ਇੱਕ ਨਮੂਨੇ ਵਜੋਂ ਵਰਤਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।
ਰੀਅਲ-ਟਾਈਮ-ਪੀਸੀਆਰ ਅਤੇ qPCR(ਕੁਆਂਟੀਟੇਟਿਵ ਰੀਏ-ਐਲਟਾਈਮ-ਪੀਸੀਆਰ) ਇੱਕੋ ਚੀਜ਼ ਹਨ, ਦੋਵੇਂ ਅਸਲ-ਸਮੇਂ ਦੀ ਮਾਤਰਾਤਮਕ ਪੀਸੀਆਰ ਹਨ, ਜਿਸਦਾ ਮਤਲਬ ਹੈ ਕਿ ਪੀਸੀਆਰ ਦੇ ਹਰੇਕ ਚੱਕਰ ਵਿੱਚ ਅਸਲ-ਸਮੇਂ ਦੇ ਡੇਟਾ ਰਿਕਾਰਡ ਹੁੰਦੇ ਹਨ, ਇਸਲਈ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਟੈਂਪਲੇਟਾਂ ਦੀ ਸੰਖਿਆ ਨੂੰ ਸਟੀਕ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਵਿਵਸਥਿਤ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।

ਹਾਲਾਂਕਿ ਰੀਅਲ-ਟਾਈਮ ਪੀਸੀਆਰ (ਰੀਅਲ-ਟਾਈਮ ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਕੁਆਂਟੀਟੇਟਿਵ ਪੀਸੀਆਰ) ਅਤੇ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਪੀਸੀਆਰ (ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਪੀਸੀਆਰ) ਨੂੰ ਆਰਟੀ-ਪੀਸੀਆਰ ਵਜੋਂ ਸੰਖੇਪ ਕੀਤਾ ਜਾਪਦਾ ਹੈ, ਅੰਤਰਰਾਸ਼ਟਰੀ ਪਰੰਪਰਾ ਹੈ: ਆਰਟੀ-ਪੀਸੀਆਰ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਤੌਰ 'ਤੇ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਦਾ ਹਵਾਲਾ ਦਿੰਦਾ ਹੈ।PCR, ਰੀਅਲ-ਟਾਈਮ PCR ਨੂੰ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ qPCR (ਗੁਣਾਤਮਕ ਰੀਅਲ-ਟਾਈਮ PCR) ਕਿਹਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।.

ਅਤੇ ਰੀਅਲ-ਟਾਈਮ RT-PCR (RT-qPCR), ਇਹ ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਮਾਤਰਾਤਮਕ ਤਕਨਾਲੋਜੀ ਦੇ ਨਾਲ ਮਿਲਾ ਕੇ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਪੀ.ਸੀ.ਆਰ.: ਪਹਿਲਾਂ RNA ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਤੋਂ cDNA (RT) ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰੋ, ਅਤੇ ਫਿਰ ਮਾਤਰਾਤਮਕ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ (qPCR) ਲਈ ਰੀਅਲ-ਟਾਈਮ ਪੀਸੀਆਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ।ਜ਼ਿਆਦਾਤਰ ਪ੍ਰਯੋਗਸ਼ਾਲਾਵਾਂ RT-qPCR ਕਰਦੀਆਂ ਹਨ, ਯਾਨੀ, RNA ਸਮੀਕਰਨ ਡਾਊਨ-ਰੈਗੂਲੇਸ਼ਨ 'ਤੇ ਖੋਜ, ਇਸਲਈ qPCR ਜਿਸ ਬਾਰੇ ਹਰ ਕੋਈ ਪ੍ਰਯੋਗਸ਼ਾਲਾ ਵਿੱਚ ਗੱਲ ਕਰਦਾ ਹੈ ਅਸਲ ਵਿੱਚ RT-qPCR ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ, ਪਰ ਇਹ ਨਾ ਭੁੱਲੋ ਕਿ ਕਲੀਨਿਕਲ ਐਪਲੀਕੇਸ਼ਨਾਂ ਵਿੱਚ ਅਜੇ ਵੀ ਬਹੁਤ ਸਾਰੇ DNA ਟੈਸਟ ਹਨ।ਮਾਤਰਾਤਮਕ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਹੈਪੇਟਾਈਟਸ ਬੀ ਵਾਇਰਸ ਐਚਬੀਵੀ ਖੋਜ।

ਸਵਾਲ: ਬਹੁਤ ਸਾਰੇ ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਮਾਤਰਾਤਮਕ ਪੀਸੀਆਰ ਨੂੰ ਪੜ੍ਹਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਐਂਪਲੀਫਾਈਡ ਫਰੈਗਮੈਂਟ ਨੂੰ 80-300bp ਦੀ ਰੇਂਜ ਦੇ ਅੰਦਰ ਕਿਉਂ ਕੰਟਰੋਲ ਕੀਤਾ ਜਾਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ?

ਜਵਾਬ: ਹਰੇਕ ਜੀਨ ਕ੍ਰਮ ਦੀ ਲੰਬਾਈ ਵੱਖਰੀ ਹੁੰਦੀ ਹੈ, ਕੁਝ ਕਈ kb, ਕੁਝ ਸੈਂਕੜੇ bp ਹੁੰਦੇ ਹਨ, ਪਰ ਸਾਨੂੰ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਕਰਨ ਵੇਲੇ ਉਤਪਾਦ ਦੀ ਲੰਬਾਈ 80-300bp ਦੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ, ਬਹੁਤ ਛੋਟੇ ਜਾਂ ਬਹੁਤ ਲੰਬੇ ਫਲੋਰੋਸੈੰਟ ਮਾਤਰਾਤਮਕ PCR ਖੋਜ ਲਈ ਢੁਕਵੇਂ ਨਹੀਂ ਹੁੰਦੇ।ਉਤਪਾਦ ਦਾ ਟੁਕੜਾ ਪ੍ਰਾਈਮਰ-ਡਾਇਮਰ ਤੋਂ ਵੱਖਰਾ ਕਰਨ ਲਈ ਬਹੁਤ ਛੋਟਾ ਹੈ।ਪ੍ਰਾਈਮਰ-ਡਾਇਮਰ ਦੀ ਲੰਬਾਈ ਲਗਭਗ 30-40bp ਹੈ, ਅਤੇ ਇਹ ਫਰਕ ਕਰਨਾ ਮੁਸ਼ਕਲ ਹੈ ਕਿ ਇਹ ਇੱਕ ਪ੍ਰਾਈਮਰ-ਡਾਇਮਰ ਹੈ ਜਾਂ ਇੱਕ ਉਤਪਾਦ ਜੇਕਰ ਇਹ 80bp ਤੋਂ ਘੱਟ ਹੈ।ਜੇ ਉਤਪਾਦ ਦਾ ਟੁਕੜਾ ਬਹੁਤ ਲੰਬਾ ਹੈ, 300bp ਤੋਂ ਵੱਧ ਹੈ, ਤਾਂ ਇਹ ਆਸਾਨੀ ਨਾਲ ਘੱਟ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਵੱਲ ਲੈ ਜਾਵੇਗਾ ਅਤੇ ਜੀਨ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਨੂੰ ਪ੍ਰਭਾਵਸ਼ਾਲੀ ਢੰਗ ਨਾਲ ਖੋਜ ਨਹੀਂ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ।

ਉਦਾਹਰਨ ਲਈ, ਜਦੋਂ ਤੁਸੀਂ ਗਿਣਤੀ ਕਰਦੇ ਹੋ ਕਿ ਕਲਾਸਰੂਮ ਵਿੱਚ ਕਿੰਨੇ ਲੋਕ ਹਨ, ਤਾਂ ਤੁਹਾਨੂੰ ਸਿਰਫ਼ ਇਹ ਗਿਣਨ ਦੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ ਕਿ ਕਿੰਨੇ ਮੂੰਹ ਹਨ।ਇਹੀ ਸੱਚ ਹੈ ਜਦੋਂ ਤੁਸੀਂ ਜੀਨਾਂ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾਉਂਦੇ ਹੋ, ਤਾਂ ਤੁਹਾਨੂੰ ਸਿਰਫ਼ ਇੱਕ ਜੀਨ ਦੇ ਇੱਕ ਨਿਸ਼ਚਿਤ ਕ੍ਰਮ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾਉਣ ਦੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ ਤਾਂ ਜੋ ਸਮੁੱਚਾ ਕ੍ਰਮ ਕਰੇਗਾ।ਜੇ ਤੁਸੀਂ ਲੋਕਾਂ ਦੀ ਗਿਣਤੀ ਕਰਨੀ ਚਾਹੁੰਦੇ ਹੋ, ਤਾਂ ਤੁਹਾਨੂੰ ਮੂੰਹ ਅਤੇ ਨੱਕ, ਕੰਨ ਅਤੇ ਐਨਕਾਂ ਦੋਵਾਂ ਦੀ ਗਿਣਤੀ ਕਰਨੀ ਪਵੇਗੀ, ਅਤੇ ਗਲਤੀਆਂ ਕਰਨਾ ਆਸਾਨ ਹੈ।

ਵਿਸਤਾਰ ਕਰਨ ਲਈ, ਜੀਵ-ਵਿਗਿਆਨਕ ਖੋਜ ਵਿੱਚ, ਬਿੰਦੂ ਤੋਂ ਖੇਤਰ ਤੱਕ ਬਹੁਤ ਸਾਰੇ ਖੋਜ ਕੇਸ ਹਨ, ਕਿਉਂਕਿ ਕਿਸੇ ਵੀ ਸਪੀਸੀਜ਼ ਦਾ ਜੀਨ ਕ੍ਰਮ ਬਹੁਤ ਲੰਬਾ ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਸਾਰੇ ਟੁਕੜਿਆਂ ਨੂੰ ਮਾਪਣਾ ਬੇਲੋੜਾ ਅਤੇ ਅਸੰਭਵ ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਬੈਕਟੀਰੀਆ 16S ਕ੍ਰਮ, ਜੋ ਕਿ ਬੈਕਟੀਰੀਆ ਦੇ ਰੂੜੀਵਾਦੀ ਕ੍ਰਮ ਨੂੰ ਪੂਰਾ ਕਰਨ ਲਈ ਇੱਕ ਨਿਸ਼ਚਿਤ ਆਬਾਦੀ ਦੀ ਸੰਖਿਆ b ਦਾ ਅਨੁਮਾਨ ਲਗਾਉਣ ਲਈ ਅਸੈਸ ਕਰਦਾ ਹੈ।

ਸਵਾਲ: qPCR ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਲਈ ਅਨੁਕੂਲ ਲੰਬਾਈ ਕੀ ਹੈ?

ਜਵਾਬ: ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਦੀ ਲੰਬਾਈ ਲਗਭਗ 20-24bp ਹੈ, ਜੋ ਕਿ ਬਿਹਤਰ ਹੈ।ਬੇਸ਼ੱਕ, ਸਾਨੂੰ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਨੂੰ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਕਰਦੇ ਸਮੇਂ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਦੇ ਟੀਐਮ ਮੁੱਲ ਵੱਲ ਧਿਆਨ ਦੇਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ, ਕਿਉਂਕਿ ਇਹ ਅਨੁਕੂਲ ਐਨੀਲਿੰਗ ਤਾਪਮਾਨ ਨਾਲ ਸਬੰਧਤ ਹੈ।ਬਹੁਤ ਸਾਰੇ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਇਹ ਸਾਬਤ ਹੋ ਗਿਆ ਹੈ ਕਿ 60° C ਇੱਕ ਬਿਹਤਰ TM ਮੁੱਲ ਹੈ।ਜੇ ਐਨੀਲਿੰਗ ਦਾ ਤਾਪਮਾਨ ਬਹੁਤ ਘੱਟ ਹੈ, ਤਾਂ ਇਹ ਆਸਾਨੀ ਨਾਲ ਗੈਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਵੱਲ ਲੈ ਜਾਵੇਗਾ।ਜੇ ਐਨੀਲਿੰਗ ਤਾਪਮਾਨ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਹੈ, ਤਾਂ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਮੁਕਾਬਲਤਨ ਘੱਟ ਹੋਵੇਗੀ, ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਕਰਵ ਦੀ ਸਿਖਰ ਬਾਅਦ ਵਿੱਚ ਸ਼ੁਰੂ ਹੋਵੇਗੀ, ਅਤੇ ਸੀਟੀ ਮੁੱਲ ਵਿੱਚ ਦੇਰੀ ਹੋਵੇਗੀ।

ਸਵਾਲ: ਡਾਈ ਵਿਧੀ ਜਾਂਚ ਵਿਧੀ ਤੋਂ ਕਿਵੇਂ ਵੱਖਰੀ ਹੈ?

ਉੱਤਰ: ਡਾਈ ਵਿਧੀਕੁਝ ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਰੰਗ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ SYBR ਗ੍ਰੀਨ Ⅰ, ਪਿਕੋਗ੍ਰੀਨ, BEBO, ਆਦਿ, ਆਪਣੇ ਆਪ ਰੋਸ਼ਨੀ ਨਹੀਂ ਛੱਡਦੇ, ਪਰ ਡਬਲ-ਸਟ੍ਰੈਂਡਡ ਡੀਐਨਏ ਦੇ ਮਾਮੂਲੀ ਨਾਲੀ ਨਾਲ ਬੰਨ੍ਹਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਨੂੰ ਛੱਡਣਗੇ।ਇਸ ਲਈ, ਪੀਸੀਆਰ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਦੀ ਸ਼ੁਰੂਆਤ ਵਿੱਚ, ਮਸ਼ੀਨ ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਸਿਗਨਲ ਦਾ ਪਤਾ ਨਹੀਂ ਲਗਾ ਸਕਦੀ ਹੈ।ਜਦੋਂ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਐਨੀਲਿੰਗ-ਐਕਸਟੇਂਸ਼ਨ ਪੜਾਅ 'ਤੇ ਪਹੁੰਚ ਜਾਂਦੀ ਹੈ, ਤਾਂ ਡਬਲ ਸਟ੍ਰੈਂਡ ਖੋਲ੍ਹਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਡੀਐਨਏ ਪੋਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਦੀ ਕਿਰਿਆ ਦੇ ਤਹਿਤ ਇੱਕ ਨਵਾਂ ਸਟ੍ਰੈਂਡ ਸਿੰਥੇਸਾਈਜ਼ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਅਣੂ dsDNA ਮਾਈਨਰ ਗਰੂਵ ਨਾਲ ਜੁੜ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਪੀਸੀਆਰ ਚੱਕਰਾਂ ਦੀ ਗਿਣਤੀ ਵਧਦੀ ਹੈ, ਵੱਧ ਤੋਂ ਵੱਧ ਰੰਗਾਂ ਨੂੰ ਡਬਲ-ਸਟ੍ਰੈਂਡਡ ਡੀਐਨਏ ਨਾਲ ਜੋੜਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਸਿਗਨਲ ਨੂੰ ਵੀ ਲਗਾਤਾਰ ਵਧਾਇਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਡਾਈ ਵਿਧੀ ਮੁੱਖ ਤੌਰ 'ਤੇ ਵਿਗਿਆਨਕ ਖੋਜ ਵਿੱਚ ਵਰਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ।
PS: ਪ੍ਰਯੋਗ ਕਰਦੇ ਸਮੇਂ ਸਾਵਧਾਨ ਰਹੋ, ਰੰਗ ਨੂੰ ਮਨੁੱਖੀ ਡੀਐਨਏ ਨਾਲ ਜੋੜਿਆ ਜਾਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ, ਇਸਨੂੰ ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਵਿਅਕਤੀ ਵਿੱਚ ਬਦਲਣ ਲਈ ਸਾਵਧਾਨ ਰਹੋ।

ਡਾਈ ਵਿਧੀ (ਖੱਬੇ) ਪੜਤਾਲ ਵਿਧੀ (ਸੱਜੇ)
PS: ਪ੍ਰਯੋਗ ਕਰਦੇ ਸਮੇਂ ਸਾਵਧਾਨ ਰਹੋ, ਰੰਗ ਨੂੰ ਮਨੁੱਖੀ ਡੀਐਨਏ ਨਾਲ ਜੋੜਿਆ ਜਾਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ, ਇਸਨੂੰ ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਵਿਅਕਤੀ ਵਿੱਚ ਬਦਲਣ ਲਈ ਸਾਵਧਾਨ ਰਹੋ।

SYBR ਗ੍ਰੀਨ Ⅰ ਡੀਐਨਏ ਦੀ ਮਾਮੂਲੀ ਨਾਲੀ ਨਾਲ ਜੁੜਦਾ ਹੈ

ਜਾਂਚ ਵਿਧੀਤਾਕਮਨ ਪੜਤਾਲ ਸਭ ਤੋਂ ਵੱਧ ਵਰਤੀ ਜਾਣ ਵਾਲੀ ਹਾਈਡੋਲਿਸਿਸ ਪੜਤਾਲ ਹੈ।ਪੜਤਾਲ ਦੇ 5′ ਸਿਰੇ 'ਤੇ ਇੱਕ ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਸਮੂਹ ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ FAM, ਅਤੇ ਪੜਤਾਲ ਆਪਣੇ ਆਪ ਵਿੱਚ ਟੀਚੇ ਦੇ ਜੀਨ ਲਈ ਇੱਕ ਕ੍ਰਮ ਪੂਰਕ ਹੁੰਦੀ ਹੈ।3′ ਸਿਰੇ 'ਤੇ ਇੱਕ ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਬੁਝਾਉਣ ਵਾਲਾ ਸਮੂਹ ਹੁੰਦਾ ਹੈ।ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਰੈਜ਼ੋਨੈਂਸ ਐਨਰਜੀ ਟ੍ਰਾਂਸਫਰ (Förster resonance energy transfer, FRET) ਦੇ ਸਿਧਾਂਤ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ, ਜਦੋਂ ਰਿਪੋਟਰ ਫਲੋਰੋਸੈੰਟ ਸਮੂਹ (ਦਾਨੀ ਫਲੋਰੋਸੈੰਟ ਅਣੂ) ਅਤੇ ਬੁਝਾਉਣ ਵਾਲਾ ਫਲੋਰੋਸੈੰਟ ਸਮੂਹ (ਸਵੀਕਾਰ ਕਰਨ ਵਾਲਾ ਫਲੋਰੋਸੈੰਟ ਅਣੂ) ਉਤੇਜਿਤ ਹੁੰਦੇ ਹਨ, ਜਦੋਂ ਸਪੈਕਟਰਾ ਓਵਰਲੈਪ ਹੁੰਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਦੂਰੀ ਬਹੁਤ ਨੇੜੇ ਹੋ ਜਾਂਦੀ ਹੈ, ਤਾਂ ਦੂਰੀ 1000 ਮੀਟਰ ਦੀ ਦੂਰੀ ਦੇ ਨੇੜੇ ਹੋ ਸਕਦੀ ਹੈ। ਸਵੀਕਾਰ ਕਰਨ ਵਾਲੇ ਅਣੂ ਦਾ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ, ਜਦੋਂ ਕਿ ਆਟੋਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਕਮਜ਼ੋਰ ਹੁੰਦਾ ਹੈ।ਇਸ ਲਈ, ਪੀਸੀਆਰ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਦੀ ਸ਼ੁਰੂਆਤ ਵਿੱਚ, ਜਦੋਂ ਜਾਂਚ ਸਿਸਟਮ ਵਿੱਚ ਸੁਤੰਤਰ ਅਤੇ ਬਰਕਰਾਰ ਹੁੰਦੀ ਹੈ, ਤਾਂ ਰਿਪੋਰਟਰ ਫਲੋਰੋਸੈੰਟ ਗਰੁੱਪ ਫਲੋਰੋਸੈੰਟ ਨਹੀਂ ਛੱਡੇਗਾ।ਐਨੀਲਿੰਗ ਕਰਨ ਵੇਲੇ, ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਅਤੇ ਪੜਤਾਲ ਟੈਂਪਲੇਟ ਨਾਲ ਜੁੜ ਜਾਂਦੇ ਹਨ।ਐਕਸਟੈਂਸ਼ਨ ਪੜਾਅ ਦੇ ਦੌਰਾਨ, ਪੌਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਲਗਾਤਾਰ ਨਵੀਆਂ ਚੇਨਾਂ ਦਾ ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਕਰਦਾ ਹੈ।ਡੀਐਨਏ ਪੋਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਵਿੱਚ 5′-3′ ਐਕਸੋਨੁਕਲੀਜ਼ ਗਤੀਵਿਧੀ ਹੁੰਦੀ ਹੈ।ਜਾਂਚ ਤੱਕ ਪਹੁੰਚਣ 'ਤੇ, ਡੀਐਨਏ ਪੋਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਟੈਂਪਲੇਟ ਤੋਂ ਜਾਂਚ ਨੂੰ ਹਾਈਡ੍ਰੋਲਾਈਜ਼ ਕਰੇਗਾ, ਰਿਪੋਰਟਰ ਫਲੋਰੋਸੈੰਟ ਗਰੁੱਪ ਨੂੰ ਕਵੇਨਚਰ ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਗਰੁੱਪ ਤੋਂ ਵੱਖ ਕਰੇਗਾ, ਅਤੇ ਫਲੋਰੋਸੈੰਟ ਸਿਗਨਲ ਜਾਰੀ ਕਰੇਗਾ।ਕਿਉਂਕਿ ਜਾਂਚ ਅਤੇ ਟੈਂਪਲੇਟ ਵਿਚਕਾਰ ਇੱਕ-ਨਾਲ-ਇੱਕ ਸਬੰਧ ਹੈ, ਜਾਂਚ ਦੀ ਸ਼ੁੱਧਤਾ ਅਤੇ ਸੰਵੇਦਨਸ਼ੀਲਤਾ ਦੇ ਮਾਮਲੇ ਵਿੱਚ ਜਾਂਚ ਵਿਧੀ ਡਾਈ ਵਿਧੀ ਨਾਲੋਂ ਉੱਤਮ ਹੈ।ਜਾਂਚ ਵਿਧੀ ਮੁੱਖ ਤੌਰ 'ਤੇ ਨਿਦਾਨ ਵਿੱਚ ਵਰਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ।

ਸਵਾਲ: ਪੂਰਨ ਮਾਤਰਾ ਕੀ ਹੈ?ਰਿਸ਼ਤੇਦਾਰ ਮਾਤਰਾ ਕੀ ਹੈ?

ਜਵਾਬ: ਸੰਪੂਰਨ ਮਾਤਰਾ qPCR ਦੁਆਰਾ ਟੈਸਟ ਕੀਤੇ ਜਾਣ ਵਾਲੇ ਨਮੂਨੇ ਦੀ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਕਾਪੀ ਨੰਬਰ ਦੀ ਗਣਨਾ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੀ ਹੈ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਖੂਨ ਦੇ 1ml ਵਿੱਚ ਕਿੰਨੇ HBV ਵਾਇਰਸ ਹਨ।ਸਾਪੇਖਿਕ ਮਾਪਦੰਡ ਦੁਆਰਾ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤਾ ਨਤੀਜਾ ਕਿਸੇ ਹੋਰ ਸੰਦਰਭ ਨਮੂਨੇ ਦੇ ਸਬੰਧ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਖਾਸ ਨਮੂਨੇ ਵਿੱਚ ਟੀਚਾ ਜੀਨ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਵਿੱਚ ਤਬਦੀਲੀ ਹੈ, ਅਤੇ ਜੀਨ ਸਮੀਕਰਨ ਉੱਪਰ-ਨਿਯੰਤ੍ਰਿਤ ਜਾਂ ਹੇਠਾਂ-ਨਿਯੰਤ੍ਰਿਤ ਹੈ।

ਸਵਾਲ: ਕੀ ਆਰਐਨਏ ਕੱਢਣ ਦੀ ਮਾਤਰਾ, ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਕੁਸ਼ਲਤਾ, ਅਤੇ ਐਂਪਲੀਫੀਕੇਸ਼ਨ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਨਤੀਜਿਆਂ ਨੂੰ ਪ੍ਰਭਾਵਤ ਕਰੇਗੀ?
ਸਵਾਲ: ਕੀ ਨਮੂਨਾ ਸਟੋਰੇਜ, ਐਕਸਟਰੈਕਸ਼ਨ ਰੀਐਜੈਂਟਸ, ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਰੀਐਜੈਂਟਸ, ਅਤੇ ਲਾਈਟ-ਪ੍ਰਸਾਰਿਤ ਕਰਨ ਵਾਲੀਆਂ ਖਪਤਕਾਰਾਂ ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਨਤੀਜਿਆਂ ਨੂੰ ਪ੍ਰਭਾਵਤ ਕਰਨਗੇ?
ਸਵਾਲ: ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਡੇਟਾ ਨੂੰ ਕਿਹੜੀ ਵਿਧੀ ਠੀਕ ਕਰ ਸਕਦੀ ਹੈ?

ਇਹਨਾਂ ਮੁੱਦਿਆਂ ਦੇ ਸੰਬੰਧ ਵਿੱਚ, ਅਸੀਂ ਹੇਠਾਂ ਦਿੱਤੇ ਉੱਨਤ ਅਤੇ ਉੱਨਤ ਭਾਗਾਂ ਵਿੱਚ ਉਹਨਾਂ ਦਾ ਵਿਸਥਾਰ ਵਿੱਚ ਵਰਣਨ ਕਰਾਂਗੇ।
2. ਉੱਨਤ ਗਿਆਨ

ਰੀਅਲ-ਟਾਈਮ ਫਲੋਰੋਸੈੰਟ ਮਾਤਰਾਤਮਕ ਪੀਸੀਆਰ ਦੇ ਸਬੰਧ ਵਿੱਚ, ਸਾਨੂੰ ਅਸਲੀਅਤ ਨੂੰ ਪਛਾਣਨਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ ਕਿ ਹਰ ਸਾਲ ਹਜ਼ਾਰਾਂ ਵਿਗਿਆਨਕ ਖੋਜ ਪੱਤਰ ਪ੍ਰਕਾਸ਼ਿਤ ਹੁੰਦੇ ਹਨ, ਜਿਨ੍ਹਾਂ ਵਿੱਚ ਫਲੋਰੋਸੈੰਟ ਮਾਤਰਾਤਮਕ ਪੀਸੀਆਰ ਤਕਨਾਲੋਜੀ ਛੋਟੀ ਗਿਣਤੀ ਨਹੀਂ ਹੈ।

ਜੇਕਰ ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਮਾਤਰਾਤਮਕ PCR ਪ੍ਰਯੋਗ ਨੂੰ ਮਾਪਣ ਲਈ ਕੋਈ ਆਮ ਮਿਆਰ ਨਹੀਂ ਹੈ, ਤਾਂ ਨਤੀਜੇ ਵਿਆਪਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਹੋ ਸਕਦੇ ਹਨ।ਇੱਕੋ ਪ੍ਰਜਾਤੀ ਦੇ ਇੱਕੋ ਜੀਨ ਲਈ, ਇੱਕੋ ਪ੍ਰੋਸੈਸਿੰਗ ਵਿਧੀ ਨਾਲ, ਖੋਜ ਦੇ ਨਤੀਜੇ ਵੀ ਵਿਆਪਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਵੱਖੋ-ਵੱਖਰੇ ਹੋਣਗੇ, ਅਤੇ ਦੇਰ ਨਾਲ ਆਉਣ ਵਾਲਿਆਂ ਲਈ ਉਹੀ ਨਤੀਜਿਆਂ ਨੂੰ ਦੁਹਰਾਉਣਾ ਮੁਸ਼ਕਲ ਹੋਵੇਗਾ।ਤੁਹਾਨੂੰ ਕੋਈ ਨਹੀਂ ਜਾਣਦਾ ਕਿ ਕੀ ਸਹੀ ਹੈ ਅਤੇ ਕੀ ਗਲਤ ਹੈ।

ਕੀ ਇਸਦਾ ਮਤਲਬ ਇਹ ਹੈ ਕਿ ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਮਾਤਰਾਤਮਕ ਪੀਸੀਆਰ ਇੱਕ ਧੋਖਾਧੜੀ ਤਕਨੀਕ ਹੈ ਜਾਂ ਇੱਕ ਭਰੋਸੇਯੋਗ ਤਕਨਾਲੋਜੀ ਹੈ?ਨਹੀਂ, ਇਹ ਇਸ ਲਈ ਹੈ ਕਿਉਂਕਿ ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਮਾਤਰਾਤਮਕ ਪੀਸੀਆਰ ਵਧੇਰੇ ਸੰਵੇਦਨਸ਼ੀਲ ਅਤੇ ਵਧੇਰੇ ਸਹੀ ਹੈ, ਅਤੇ ਥੋੜਾ ਜਿਹਾ ਗਲਤ ਕਾਰਵਾਈ ਪੂਰੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਉਲਟ ਨਤੀਜੇ ਦੇਵੇਗੀ।ਇੱਕ ਛੋਟਾ ਜਿਹਾ ਨੁਕਸਾਨ ਇੱਕ ਹਜ਼ਾਰ ਮੀਲ ਦੂਰ ਹੈ.ਲੇਖ ਦੇ ਲੇਖਕ ਨੂੰ ਸਮੀਖਿਅਕਾਂ ਦੁਆਰਾ ਵਾਰ-ਵਾਰ ਤਸੀਹੇ ਦਿੱਤੇ ਜਾ ਸਕਦੇ ਹਨ।ਇਸ ਦੇ ਨਾਲ ਹੀ, ਜਰਨਲ ਦੇ ਸਮੀਖਿਅਕਾਂ ਨੂੰ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਨਤੀਜਿਆਂ ਵਿੱਚੋਂ ਚੁਣਨਾ ਵੀ ਔਖਾ ਹੈ।

ਕੁੱਲ ਮਿਲਾ ਕੇ, ਰੀਅਲ-ਟਾਈਮ ਪੀਸੀਆਰ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਵਿੱਚ ਸਹਿਮਤੀ ਦੀ ਘਾਟ ਵੱਲ ਇਸ਼ਾਰਾ ਕਰਦਾ ਹੈ।ਇਸ ਲਈ, ਉਦਯੋਗ ਦੇ ਸੀਨੀਅਰ ਵਿਗਿਆਨੀਆਂ ਨੇ ਮਿਆਰ ਬਣਾਉਣਾ ਸ਼ੁਰੂ ਕੀਤਾ,ਇਹਨਾਂ ਮਿਆਰਾਂ ਨੂੰ ਪੂਰਾ ਕਰਨ ਲਈ ਲੇਖ ਵਿੱਚ ਕੁਝ ਜ਼ਰੂਰੀ ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਅਤੇ ਡੇਟਾ ਪ੍ਰੋਸੈਸਿੰਗ ਵੇਰਵੇ (ਜ਼ਰੂਰੀ ਡੇਟਾ ਸਮੇਤ) ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰਨ ਲਈ ਯੋਗਦਾਨ ਪਾਉਣ ਵਾਲਿਆਂ ਦੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ।

ਸਮੀਖਿਅਕ ਇਹਨਾਂ ਵੇਰਵਿਆਂ ਨੂੰ ਪੜ੍ਹ ਕੇ ਪ੍ਰਯੋਗ ਦੀ ਗੁਣਵੱਤਾ ਦਾ ਨਿਰਣਾ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹਨ;ਭਵਿੱਖ ਦੇ ਪਾਠਕ ਪ੍ਰਯੋਗ ਨੂੰ ਦੁਹਰਾਉਣ ਜਾਂ ਪ੍ਰਯੋਗ ਨੂੰ ਬਿਹਤਰ ਬਣਾਉਣ ਲਈ ਵੀ ਇਸਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹਨ।ਫਿਰ ਇਸ ਤਰੀਕੇ ਨਾਲ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੇ ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਨਤੀਜੇ ਜਾਣਕਾਰੀ ਨਾਲ ਭਰਪੂਰ, ਉੱਚ ਗੁਣਵੱਤਾ ਅਤੇ ਵਰਤੋਂ ਯੋਗ ਹਨ.

MIBBI (ਬਾਇਓਲੋਜੀਕਲ ਅਤੇ ਬਾਇਓਮੈਡੀਕਲ ਜਾਂਚਾਂ ਲਈ ਘੱਟੋ-ਘੱਟ ਜਾਣਕਾਰੀ -http://www.mibbi.org) ਹੋਂਦ ਵਿੱਚ ਆਇਆ।MIBBI ਇੱਕ ਪ੍ਰੋਜੈਕਟ ਹੈ ਜੋ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਲਈ ਮਿਆਰ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰਦਾ ਹੈ.ਇਹ ਕੁਦਰਤ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਕਾਸ਼ਿਤ ਹੁੰਦਾ ਹੈ.ਇਸ ਪ੍ਰੋਜੈਕਟ ਦਾ ਉਦੇਸ਼ ਸੈੱਲ ਬਾਇਓਲੋਜੀ, ਮਾਈਕਰੋਏਰੇ, qPCR ਜਿਸ ਬਾਰੇ ਅਸੀਂ ਹੁਣ ਚਰਚਾ ਕਰਨ ਜਾ ਰਹੇ ਹਾਂ, ਆਦਿ ਸਮੇਤ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਜੀਵ-ਵਿਗਿਆਨਕ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਲਈ ਹੈ, ਅਤੇ ਹੱਥ-ਲਿਖਤਾਂ ਨੂੰ ਜਮ੍ਹਾਂ ਕਰਨ ਵੇਲੇ ਹਰੇਕ ਕਿਸਮ ਦੇ ਪ੍ਰਯੋਗ ਲਈ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰਦਾ ਹੈ।ਇਹ ਜਾਣਕਾਰੀ ਹਰ ਸਮੇਂ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕੀਤੀ ਜਾਣੀ ਚਾਹੀਦੀ ਹੈ।

MIBBI ਪ੍ਰੋਜੈਕਟ ਵਿੱਚ, ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਮਾਤਰਾਤਮਕ ਪੀਸੀਆਰ ਨਾਲ ਸਬੰਧਤ ਦੋ ਲੇਖ ਹਨ, ਅਰਥਾਤ:
·ਆਰਡੀਐਮਐਲ (ਰੀਅਲ-ਟਾਈਮ ਪੀਸੀਆਰ ਡੇਟਾ ਮਾਰਕਅੱਪ ਲੈਂਗੂਏਜ) – ਰੀਅਲ-ਟਾਈਮ ਮਾਤਰਾਤਮਕ ਪੀਸੀਆਰ ਡੇਟਾ ਲਈ ਇੱਕ ਢਾਂਚਾਗਤ ਭਾਸ਼ਾ ਅਤੇ ਰਿਪੋਰਟਿੰਗ ਗਾਈਡ;
· MIQE (ਕੁਆਂਟੀਟੇਟਿਵ ਰੀਅਲ-ਟਾਈਮ ਪੀਸੀਆਰ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਦੇ ਪ੍ਰਕਾਸ਼ਨ ਲਈ ਘੱਟੋ-ਘੱਟ ਜਾਣਕਾਰੀ) - ਰੀਅਲ-ਟਾਈਮ ਮਾਤਰਾਤਮਕ ਪੀਸੀਆਰ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਬਾਰੇ ਲੇਖ ਪ੍ਰਕਾਸ਼ਿਤ ਕਰਨ ਲਈ ਘੱਟੋ-ਘੱਟ ਜਾਣਕਾਰੀ।
ਪਹਿਲਾਂ, ਆਉ RDML ਬਾਰੇ ਗੱਲ ਕਰੀਏ, ਸ਼ਬਦਾਵਲੀ ਨਿਰਧਾਰਨ।

ਜੇ ਹਰ ਚੀਜ਼ ਲਈ ਕੋਈ ਮਿਆਰੀ ਪਰਿਭਾਸ਼ਾ ਨਹੀਂ ਹੈ, ਤਾਂ ਚਰਚਾ ਨੂੰ ਜਾਰੀ ਰੱਖਣਾ ਅਸੰਭਵ ਹੈ, ਇਸੇ ਕਰਕੇ ਪ੍ਰੀਖਿਆ ਵਿਚ ਸ਼ਰਤਾਂ ਦੀ ਵਿਆਖਿਆ ਇੰਨੀ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਹੈ.
ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਮਾਤਰਾਤਮਕ PCR ਪ੍ਰਯੋਗ ਵਿੱਚ ਵਰਤੀ ਗਈ ਸ਼ਬਦਾਵਲੀ ਵਿੱਚ ਹੇਠ ਲਿਖੀ ਸਮੱਗਰੀ ਸ਼ਾਮਲ ਹੈ।QIAGEN ਨੇ ਸਾਡੇ ਲਈ ਸਭ ਤੋਂ ਵਧੀਆ ਸੰਖੇਪ ਬਣਾਇਆ ਹੈ।ਹੇਠ ਲਿਖੇ ਸਾਰੇ ਸੁੱਕੇ ਹਨਮਾਲ .

ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਕਰਵ
ਐਂਪਲੀਫੀਕੇਸ਼ਨ ਕਰਵ ਪੀਸੀਆਰ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਦੇ ਦੌਰਾਨ ਕੀਤੀ ਵਕਰ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਚੱਕਰ ਨੰਬਰ ਨੂੰ ਐਬਸਸੀਸਾ ਅਤੇ ਰੀਅਲ-ਟਾਈਮ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਤੀਬਰਤਾ ਨੂੰ ਆਰਡੀਨੇਟ ਵਜੋਂ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਦੌਰਾਨ ਦਰਸਾਇਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।

ਇੱਕ ਸ਼ਾਨਦਾਰ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਕਰਵ ਵਿੱਚ ਹੇਠ ਲਿਖੀਆਂ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾਵਾਂ ਹੋਣੀਆਂ ਚਾਹੀਦੀਆਂ ਹਨ: ਬੇਸਲਾਈਨ ਫਲੈਟ ਜਾਂ ਥੋੜ੍ਹਾ ਘਟਿਆ ਹੋਇਆ ਹੈ, ਅਤੇ ਕੋਈ ਸਪੱਸ਼ਟ ਉੱਪਰ ਵੱਲ ਰੁਝਾਨ ਨਹੀਂ ਹੈ;ਕਰਵ ਦਾ ਇਨਫੈਕਸ਼ਨ ਬਿੰਦੂ ਸਪੱਸ਼ਟ ਹੈ, ਅਤੇ ਘਾਤਕ ਪੜਾਅ ਦੀ ਢਲਾਨ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਦੇ ਅਨੁਪਾਤੀ ਹੈ।ਢਲਾਨ ਜਿੰਨੀ ਜ਼ਿਆਦਾ ਹੋਵੇਗੀ, ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਉਨੀ ਜ਼ਿਆਦਾ ਹੋਵੇਗੀ;ਸਮੁੱਚੀ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਕਰਵ ਸਮਾਨਤਾ ਚੰਗੀ ਹੈ, ਇਹ ਦਰਸਾਉਂਦੀ ਹੈ ਕਿ ਹਰੇਕ ਟਿਊਬ ਦੀ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਸਮਾਨ ਹੈ;ਘੱਟ ਇਕਾਗਰਤਾ ਵਾਲੇ ਨਮੂਨਿਆਂ ਦੇ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਕਰਵ ਦਾ ਘਾਤਕ ਪੜਾਅ ਸਪੱਸ਼ਟ ਹੈ।

ਬੇਸਲਾਈਨ (ਬੇਸਲਾਈਨ)
ਬੇਸਲਾਈਨ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਚੱਕਰ ਦਾ ਸ਼ੋਰ ਪੱਧਰ ਹੈ, ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ 3rd ਅਤੇ 15 ਵੇਂ ਚੱਕਰ ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਮਾਪਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਕਿਉਂਕਿ ਇਸ ਮਿਆਦ ਦੇ ਦੌਰਾਨ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਉਤਪਾਦ ਦੁਆਰਾ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਮੁੱਲ ਵਾਧੇ ਦਾ ਪਤਾ ਨਹੀਂ ਲਗਾਇਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਬੇਸਲਾਈਨ ਦੀ ਗਣਨਾ ਕਰਨ ਲਈ ਵਰਤੇ ਜਾਣ ਵਾਲੇ ਚੱਕਰਾਂ ਦੀ ਗਿਣਤੀ ਵੱਖੋ-ਵੱਖਰੀ ਹੋ ਸਕਦੀ ਹੈ ਅਤੇ ਜੇਕਰ ਉੱਚ ਟੈਂਪਲੇਟ ਮਾਤਰਾਵਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ ਜਾਂ ਜੇਕਰ ਟੀਚਾ ਜੀਨ ਦਾ ਸਮੀਕਰਨ ਪੱਧਰ ਉੱਚਾ ਹੈ ਤਾਂ ਇਸ ਨੂੰ ਘਟਾਉਣ ਦੀ ਲੋੜ ਹੋ ਸਕਦੀ ਹੈ।

ਬੇਸਲਾਈਨ ਸੈਟ ਕਰਨ ਲਈ ਰੇਖਿਕਤਾ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਕਰਵ ਤੋਂ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਡੇਟਾ ਦੇਖਣ ਦੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ।ਬੇਸਲਾਈਨ ਸੈੱਟ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ ਤਾਂ ਕਿ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਕਰਵ ਦਾ ਵਾਧਾ ਬੇਸਲਾਈਨ ਚੱਕਰ ਦੇ ਸਿਖਰ ਨੰਬਰ ਤੋਂ ਵੱਧ ਇੱਕ ਚੱਕਰ ਨੰਬਰ ਨਾਲ ਸ਼ੁਰੂ ਹੁੰਦਾ ਹੈ।ਹਰੇਕ ਟੀਚੇ ਦੇ ਕ੍ਰਮ ਲਈ ਬੇਸਲਾਈਨਾਂ ਨੂੰ ਵੱਖਰੇ ਤੌਰ 'ਤੇ ਸੈੱਟ ਕਰਨ ਦੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ।ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਚੱਕਰਾਂ ਵਿੱਚ ਖੋਜੇ ਗਏ ਔਸਤ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਮੁੱਲਾਂ ਨੂੰ ਵਧੇ ਹੋਏ ਉਤਪਾਦਾਂ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੇ ਗਏ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਮੁੱਲਾਂ ਤੋਂ ਘਟਾਉਣ ਦੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ।ਵੱਖ-ਵੱਖ ਰੀਅਲ-ਟਾਈਮ ਪੀਸੀਆਰ ਸੌਫਟਵੇਅਰ ਦੇ ਨਵੀਨਤਮ ਸੰਸਕਰਣ ਵਿਅਕਤੀਗਤ ਨਮੂਨਿਆਂ ਲਈ ਬੇਸਲਾਈਨ ਸੈਟਿੰਗਾਂ ਦੇ ਆਟੋਮੈਟਿਕ ਅਨੁਕੂਲਤਾ ਦੀ ਆਗਿਆ ਦਿੰਦੇ ਹਨ।

ਪੀਸੀਆਰ ਐਂਪਲੀਫੀਕੇਸ਼ਨ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਦੇ ਪਹਿਲੇ ਕੁਝ ਚੱਕਰਾਂ ਦੇ ਦੌਰਾਨ, ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਸਿਗਨਲ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਨਹੀਂ ਬਦਲਦਾ।ਇੱਕ ਸਿੱਧੀ ਰੇਖਾ ਤੱਕ ਪਹੁੰਚਣ ਨੂੰ ਬੇਸਲਾਈਨ ਕਿਹਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਪਰ ਜੇਕਰ ਅਸੀਂ ਪਹਿਲੇ ਕੁਝ ਚੱਕਰਾਂ ਨੂੰ ਨੇੜਿਓਂ ਦੇਖਦੇ ਹਾਂ, ਤਾਂ ਅਸੀਂ ਦੇਖਦੇ ਹਾਂ ਕਿ ਬੇਸਲਾਈਨ ਦੇ ਅੰਦਰ ਉਹ ਹੈ ਜੋ ਹੇਠਾਂ ਦਿੱਤੀ ਤਸਵੀਰ ਵਿੱਚ ਹੋ ਰਿਹਾ ਹੈ।

ਪਿਛੋਕੜ ਦੀ ਪਿੱਠਭੂਮੀ ਦਾ ਹਵਾਲਾ ਦਿੰਦਾ ਹੈ
ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਵਿੱਚ ਗੈਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਫਲੋਰਸੈਂਸ ਮੁੱਲ।ਉਦਾਹਰਨ ਲਈ: ਅਕੁਸ਼ਲ ਫਲੋਰਸੈਂਸ ਬੁਝਾਉਣਾ;ਜਾਂ SYBR ਗ੍ਰੀਨ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਦੇ ਕਾਰਨ ਵੱਡੀ ਗਿਣਤੀ ਵਿੱਚ ਡਬਲ-ਸਟ੍ਰੈਂਡਡ ਡੀਐਨਏ ਟੈਂਪਲੇਟਸ।ਸਿਗਨਲ ਦੇ ਪਿਛੋਕੜ ਵਾਲੇ ਭਾਗਾਂ ਨੂੰ ਰੀਅਲ-ਟਾਈਮ ਪੀਸੀਆਰ ਸੌਫਟਵੇਅਰ ਐਲਗੋਰਿਦਮ ਦੁਆਰਾ ਗਣਿਤਿਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਹਟਾ ਦਿੱਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।

ਰਿਪੋਰਟਰ ਸਿਗਨਲ
ਰਿਪੋਰਟਰ ਸਿਗਨਲ ਰੀਅਲ-ਟਾਈਮ ਪੀਸੀਆਰ ਦੇ ਦੌਰਾਨ SYBR ਗ੍ਰੀਨ ਜਾਂ ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਲੇਬਲ ਵਾਲੇ ਕ੍ਰਮ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਪੜਤਾਲਾਂ ਦੁਆਰਾ ਤਿਆਰ ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਸਿਗਨਲ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ।

ਆਮ ਰਿਪੋਰਟਰ ਸਿਗਨਲ (RN)
RN ਹਰੇਕ ਚੱਕਰ 'ਤੇ ਮਾਪਿਆ ਗਿਆ ਪੈਸਿਵ ਰੈਫਰੈਂਸ ਡਾਈ ਦੀ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਤੀਬਰਤਾ ਦੁਆਰਾ ਵੰਡਿਆ ਗਿਆ ਰਿਪੋਰਟਰ ਡਾਈ ਦੀ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਤੀਬਰਤਾ ਦਾ ਹਵਾਲਾ ਦਿੰਦਾ ਹੈ।

ਪੈਸਿਵ ਰੈਫਰੈਂਸ ਡਾਈ
ਕੁਝ ਰੀਅਲ-ਟਾਈਮ ਪੀ.ਸੀ.ਆਰ.ਫਲੋਰੋਸੈੰਟ ਡਾਈ ROX ਨੂੰ ਫਲੋਰੋਸੈੰਟ ਸਿਗਨਲ ਨੂੰ ਆਮ ਬਣਾਉਣ ਲਈ ਅੰਦਰੂਨੀ ਸੰਦਰਭ ਵਜੋਂ ਵਰਤਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ.ਇਹ ਚੰਗੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਦੇ ਆਧਾਰ 'ਤੇ ਗਲਤ ਪਾਈਪਟਿੰਗ, ਚੰਗੀ ਸਥਿਤੀ, ਅਤੇ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਦੇ ਉਤਰਾਅ-ਚੜ੍ਹਾਅ ਦੇ ਕਾਰਨ ਭਿੰਨਤਾਵਾਂ ਲਈ ਠੀਕ ਕਰਦਾ ਹੈ।

ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਥ੍ਰੈਸ਼ਹੋਲਡ (ਥ੍ਰੈਸ਼ਹੋਲਡ)
ਬੈਕਗ੍ਰਾਉਂਡ ਮੁੱਲ ਤੋਂ ਉੱਪਰ ਅਤੇ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਕਰਵ ਦੇ ਪਠਾਰ ਮੁੱਲ ਤੋਂ ਕਾਫ਼ੀ ਹੇਠਾਂ ਐਡਜਸਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਇਹ ਪੀਸੀਆਰ ਖੋਜ ਦੀ ਲੌਗ-ਲੀਨੀਅਰ ਰੇਂਜ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹੋਏ, ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਕਰਵ ਦੇ ਰੇਖਿਕ ਖੇਤਰ ਵਿੱਚ ਪਿਆ ਹੋਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ।ਥ੍ਰੈਸ਼ਹੋਲਡ ਨੂੰ ਲੌਗ-ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਕਰਵ ਵਿਊ ਵਿੱਚ ਸੈੱਟ ਕੀਤਾ ਜਾਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ ਤਾਂ ਜੋ ਪੀਸੀਆਰ ਦੇ ਲੌਗ-ਲੀਨੀਅਰ ਪੜਾਅ ਨੂੰ ਆਸਾਨੀ ਨਾਲ ਪਛਾਣਿਆ ਜਾ ਸਕੇ।ਜੇਕਰ ਰੀਅਲ-ਟਾਈਮ ਪੀਸੀਆਰ ਵਿੱਚ ਕਈ ਟਾਰਗੇਟ ਜੀਨ ਹਨ, ਤਾਂ ਹਰ ਟੀਚੇ ਲਈ ਥ੍ਰੈਸ਼ਹੋਲਡ ਸੈੱਟ ਕੀਤਾ ਜਾਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ।ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਪੀਸੀਆਰ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਦੇ ਪਹਿਲੇ 15 ਚੱਕਰਾਂ ਦੇ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਸਿਗਨਲ ਨੂੰ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਬੈਕਗ੍ਰਾਉਂਡ ਸਿਗਨਲ ਵਜੋਂ ਵਰਤਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਥ੍ਰੈਸ਼ਹੋਲਡ ਪੀਸੀਆਰ ਦੇ ਪਹਿਲੇ 3 ਤੋਂ 15 ਚੱਕਰਾਂ ਦੇ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਸਿਗਨਲ ਦੇ ਸਟੈਂਡਰਡ ਡਿਵੀਏਸ਼ਨ ਤੋਂ 10 ਗੁਣਾ ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਥ੍ਰੈਸ਼ਹੋਲਡ ਪੀਸੀਆਰ ਦੇ ਐਕਸਪੋਨੈਂਟਲ ਫੇਜ਼ ਵਿੱਚ ਸੈੱਟ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਹਰੇਕ ਯੰਤਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ ਇਸਦੀ ਫਲੋਰਸੈਂਸ ਥ੍ਰੈਸ਼ਹੋਲਡ ਸੈੱਟ ਹੁੰਦੀ ਹੈ।

ਸਾਈਕਲ ਥ੍ਰੈਸ਼ਹੋਲਡ (CT) ਜਾਂ ਕਰਾਸਿੰਗ ਪੁਆਇੰਟ (CP)
ਉਹ ਚੱਕਰ ਜਿਸ 'ਤੇ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਕਰਵ ਥ੍ਰੈਸ਼ਹੋਲਡ ਨੂੰ ਪਾਰ ਕਰਦਾ ਹੈ (ਭਾਵ, ਉਹ ਬਿੰਦੂ ਜਿਸ 'ਤੇ ਫਲੋਰਸੈਂਸ ਖੋਜ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ ਵਧਦੀ ਹੈ)।CT ਇੱਕ ਅੰਸ਼ ਹੋ ਸਕਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਟੈਂਪਲੇਟ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਦੀ ਗਣਨਾ ਕੀਤੀ ਜਾ ਸਕਦੀ ਹੈ।CT ਮੁੱਲ ਅਨੁਭਵ ਕੀਤੇ ਗਏ ਚੱਕਰਾਂ ਦੀ ਸੰਖਿਆ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਜਦੋਂ ਹਰੇਕ PCR ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਟਿਊਬ ਵਿੱਚ ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਸਿਗਨਲ ਸੈੱਟ ਥ੍ਰੈਸ਼ਹੋਲਡ ਤੱਕ ਪਹੁੰਚਦਾ ਹੈ।ਹਰੇਕ ਟੈਮਪਲੇਟ ਦੇ CT ਮੁੱਲ ਅਤੇ ਟੈਂਪਲੇਟ ਦੀ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਕਾਪੀ ਨੰਬਰ ਦੇ ਲਘੂਗਣਕ ਵਿਚਕਾਰ ਇੱਕ ਰੇਖਿਕ ਸਬੰਧ ਹੈ,ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਕਾਪੀ ਨੰਬਰ ਵੱਧ, CT ਮੁੱਲ ਛੋਟਾ, ਅਤੇ ਉਲਟ.ਜਾਣੇ-ਪਛਾਣੇ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਕਾਪੀ ਨੰਬਰ ਵਾਲੇ ਸਟੈਂਡਰਡ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਇੱਕ ਮਿਆਰੀ ਕਰਵ ਬਣਾਇਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਅਬਸੀਸਾ CT ਮੁੱਲ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਆਰਡੀਨੇਟ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਕਾਪੀ ਨੰਬਰ ਦੇ ਲਘੂਗਣਕ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ।ਇਸ ਲਈ, ਜਿੰਨਾ ਚਿਰ ਅਣਜਾਣ ਨਮੂਨੇ ਦਾ CT ਮੁੱਲ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਨਮੂਨੇ ਦੀ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਕਾਪੀ ਸੰਖਿਆ ਨੂੰ ਮਿਆਰੀ ਕਰਵ ਤੋਂ ਗਿਣਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।

ΔCT ਮੁੱਲ
ΔCT ਮੁੱਲ ਦਾ ਵਰਣਨ ਕਰਦਾ ਹੈਟੀਚਾ ਜੀਨ ਅਤੇ ਅਨੁਸਾਰੀ ਐਂਡੋਜੇਨਸ ਸੰਦਰਭ ਜੀਨ ਸੀਟੀ ਮੁੱਲ ਵਿਚਕਾਰ ਅੰਤਰ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਹਾਊਸਕੀਪਿੰਗ ਜੀਨ, ਅਤੇ ਵਰਤੇ ਗਏ ਟੈਂਪਲੇਟ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਨੂੰ ਆਮ ਬਣਾਉਣ ਲਈ ਵਰਤਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ:
⇒ΔCT = CT (ਟਾਰਗੇਟ ਜੀਨ) - CT (ਐਂਡੋਜੇਨਸ ਰੈਫਰੈਂਸ ਜੀਨ)

ΔΔCT ਮੁੱਲ
ΔΔCT ਮੁੱਲ ਵਿਆਜ ਦੇ ਨਮੂਨੇ ਦੇ ਮੱਧਮਾਨ ΔΔCT ਮੁੱਲ (ਉਦਾਹਰਨ ਲਈ, ਉਤੇਜਿਤ ਸੈੱਲ) ਅਤੇ ਇੱਕ ਸੰਦਰਭ ਨਮੂਨੇ ਦੇ ਮੱਧਮਾਨ ΔΔCT ਮੁੱਲ (ਉਦਾਹਰਨ ਲਈ, ਅਸਥਿਰ ਸੈੱਲ) ਵਿਚਕਾਰ ਅੰਤਰ ਦਾ ਵਰਣਨ ਕਰਦਾ ਹੈ।ਸੰਦਰਭ ਨਮੂਨੇ ਨੂੰ ਕੈਲੀਬ੍ਰੇਸ਼ਨ ਨਮੂਨਾ ਵੀ ਕਿਹਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਬਾਕੀ ਸਾਰੇ ਨਮੂਨੇ ਸਾਪੇਖਿਕ ਮਾਤਰਾ ਲਈ ਇਸਦੇ ਲਈ ਆਮ ਕੀਤੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ:
⇒ΔΔCT = ਔਸਤ ΔCT (ਵਿਆਜ ਦਾ ਨਮੂਨਾ) - ਔਸਤ ΔCT (ਹਵਾਲਾ ਨਮੂਨਾ)

ਐਂਡੋਜੇਨਸ ਰੈਫਰੈਂਸ ਜੀਨ (ਐਂਡੋਜੇਨਸ ਰੈਫਰੈਂਸ ਜੀਨ)
ਐਂਡੋਜੇਨਸ ਸੰਦਰਭ ਜੀਨਾਂ ਦੇ ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਦੇ ਪੱਧਰ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਹਾਊਸਕੀਪਿੰਗ ਜੀਨ (ਹਾਊਸਕੀਪਿੰਗ ਜੀਨ), ਨਮੂਨਿਆਂ ਵਿੱਚ ਭਿੰਨ ਨਹੀਂ ਹੁੰਦੇ ਹਨ।ਸੰਦਰਭ ਜੀਨ ਦੇ CT ਮੁੱਲਾਂ ਦੀ ਟਾਰਗੇਟ ਜੀਨ ਨਾਲ ਤੁਲਨਾ ਕਰਨਾ ਟੀਚਾ ਜੀਨ ਦੇ ਸਮੀਕਰਨ ਪੱਧਰ ਨੂੰ ਇਨਪੁਟ RNA ਜਾਂ cDNA (ਉਪਰੋਕਤ ΔCT ਮੁੱਲਾਂ 'ਤੇ ਸੈਕਸ਼ਨ ਦੇਖੋ) ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਨੂੰ ਸਧਾਰਣ ਕਰਨ ਦੀ ਆਗਿਆ ਦਿੰਦਾ ਹੈ।

ਲਈ ਅੰਦਰੂਨੀ ਹਵਾਲਾ ਜੀਨ ਸਹੀRNA ਨਮੂਨਿਆਂ ਵਿੱਚ ਸੰਭਾਵਿਤ ਆਰਐਨਏ ਡਿਗਰੇਡੇਸ਼ਨ ਜਾਂ ਐਨਜ਼ਾਈਮ ਇਨਿਹਿਬਟਰਸ ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ, ਨਾਲ ਹੀ ਆਰਐਨਏ ਸਮੱਗਰੀ ਵਿੱਚ ਭਿੰਨਤਾਵਾਂ, ਉਲਟ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਕੁਸ਼ਲਤਾ, ਨਿਊਕਲੀਕ ਐਸਿਡ ਰਿਕਵਰੀ, ਅਤੇ ਨਮੂਨਾ ਹੈਂਡਲਿੰਗ।ਅਨੁਕੂਲ ਸੰਦਰਭ ਜੀਨ (ਆਂ) ਦੀ ਚੋਣ ਕਰਨ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਸੈਟਿੰਗ 'ਤੇ ਨਿਰਭਰ ਅਨੁਕੂਲ ਸੰਦਰਭ ਦੀ ਚੋਣ ਦੀ ਇਜਾਜ਼ਤ ਦੇਣ ਲਈ ਐਲਗੋਰਿਦਮ ਨੂੰ ਸੋਧਿਆ ਹੈ।

ਅੰਦਰੂਨੀ ਨਿਯੰਤਰਣ
ਇੱਕ ਨਿਯੰਤਰਣ ਕ੍ਰਮ ਜੋ ਟੀਚੇ ਦੇ ਕ੍ਰਮ ਦੇ ਸਮਾਨ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਵਿੱਚ ਵਧਾਇਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਇੱਕ ਵੱਖਰੀ ਜਾਂਚ (ਭਾਵ, ਡੁਪਲੈਕਸ ਪੀਸੀਆਰ ਕਰਨਾ) ਨਾਲ ਜਾਂਚ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ।ਅੰਦਰੂਨੀ ਨਿਯੰਤਰਣਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਅਕਸਰ ਅਸਫ਼ਲ ਪ੍ਰਸਾਰਾਂ ਨੂੰ ਰੱਦ ਕਰਨ ਲਈ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਜਦੋਂ ਨਿਸ਼ਾਨਾ ਕ੍ਰਮ ਖੋਜਿਆ ਨਹੀਂ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।
ਕੈਲੀਬ੍ਰੇਸ਼ਨ ਨਮੂਨਾ
ਇੱਕ ਹਵਾਲਾ ਨਮੂਨਾ (ਉਦਾਹਰਨ ਲਈ, ਇੱਕ ਸੈੱਲ ਲਾਈਨ ਜਾਂ ਟਿਸ਼ੂ ਤੋਂ ਸ਼ੁੱਧ ਆਰਐਨਏ) ਇੱਕ ਜੀਨ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰੀ ਸਮੀਕਰਨ ਪੱਧਰ ਨੂੰ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨ ਲਈ ਹੋਰ ਸਾਰੇ ਨਮੂਨਿਆਂ ਦੀ ਤੁਲਨਾ ਕਰਨ ਲਈ ਸੰਬੰਧਿਤ ਮਾਤਰਾ ਵਿੱਚ ਵਰਤਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਕੈਲੀਬ੍ਰੇਸ਼ਨ ਨਮੂਨਾ ਕੋਈ ਵੀ ਨਮੂਨਾ ਹੋ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਪਰ ਇਹ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਇੱਕ ਨਿਯੰਤਰਣ ਹੁੰਦਾ ਹੈ (ਉਦਾਹਰਨ ਲਈ, ਇੱਕ ਇਲਾਜ ਨਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਨਮੂਨਾ ਜਾਂ ਪ੍ਰਯੋਗ ਦੇ ਸਮੇਂ ਜ਼ੀਰੋ ਤੋਂ ਇੱਕ ਨਮੂਨਾ)।

ਸਕਾਰਾਤਮਕ ਨਿਯੰਤਰਣ
ਨਾਲ ਨਿਯੰਤਰਣ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋਟੈਂਪਲੇਟ ਦੀ ਜਾਣੀ ਜਾਂਦੀ ਮਾਤਰਾ.ਸਕਾਰਾਤਮਕ ਨਿਯੰਤਰਣਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਅਕਸਰ ਇਹ ਜਾਂਚ ਕਰਨ ਲਈ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ ਕਿ ਇੱਕ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਸੈੱਟ ਜਾਂ ਪ੍ਰਾਈਮਰ-ਪ੍ਰੋਬ ਸੈੱਟ ਸਹੀ ਢੰਗ ਨਾਲ ਕੰਮ ਕਰ ਰਿਹਾ ਹੈ ਅਤੇ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਸਹੀ ਢੰਗ ਨਾਲ ਸੈੱਟ ਕੀਤੀ ਗਈ ਹੈ।

ਕੋਈ ਟੈਂਪਲੇਟ ਕੰਟਰੋਲ ਨਹੀਂ (NTC)
ਇੱਕ ਨਿਯੰਤਰਣ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਟੈਂਪਲੇਟ ਨੂੰ ਛੱਡ ਕੇ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਦੇ ਸਾਰੇ ਜ਼ਰੂਰੀ ਹਿੱਸੇ ਸ਼ਾਮਲ ਹੁੰਦੇ ਹਨ, ਜੋ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਪਾਣੀ ਨਾਲ ਬਦਲਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।NTC ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਰੀਐਜੈਂਟ ਗੰਦਗੀ ਜਾਂ ਵਿਦੇਸ਼ੀ ਡੀਐਨਏ ਦੁਆਰਾ ਹੋਣ ਵਾਲੇ ਗੰਦਗੀ ਨੂੰ ਲੱਭ ਸਕਦੀ ਹੈ, ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ ਖੋਜ ਡੇਟਾ ਦੀ ਪ੍ਰਮਾਣਿਕਤਾ ਅਤੇ ਭਰੋਸੇਯੋਗਤਾ ਨੂੰ ਯਕੀਨੀ ਬਣਾਉਂਦਾ ਹੈ।ਐਨਟੀਸੀ ਨਿਯੰਤਰਣ ਦਾ ਵਾਧਾ ਗੰਦਗੀ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ।

ਕੋਈ RT ਕੰਟਰੋਲ ਨਹੀਂ (NRT)
ਆਰਐਨਏ ਕੱਢਣ ਦੀ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਵਿੱਚ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਜੀਨੋਮਿਕ ਡੀਐਨਏ ਹੋ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ ਬਹੁਤ ਨੁਕਸਾਨਦੇਹ ਹੈ ਅਤੇ ਡੇਟਾ ਗੁਣਵੱਤਾ ਨੂੰ ਪ੍ਰਭਾਵਿਤ ਕਰਨ ਵਾਲਾ ਦੋਸ਼ੀ ਹੈ ਅਤੇ qPCR ਦਾ ਕੁਦਰਤੀ ਦੁਸ਼ਮਣ ਹੈ, ਇਸਲਈ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਨੂੰ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਕਰਦੇ ਸਮੇਂ, ਇਸਨੂੰ ਸਿਰਫ਼ ਆਰਐਨਏ ਖੋਜ ਨੂੰ ਵਧਾਉਣ ਲਈ ਤਿਆਰ ਕੀਤਾ ਜਾਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ।ਇੱਥੇ ਦੋ ਤਰੀਕੇ ਹਨ, ਇੱਕ ਹੈ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਨੂੰ ਅੰਦਰੂਨੀ ਤੌਰ 'ਤੇ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਕਰਨਾ, ਦੂਜਾ ਡੀਐਨਏ ਨੂੰ ਪੂਰੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਹਟਾਉਣਾ ਹੈ, ਕਿਹੜਾ ਇੱਕ ਬਿਹਤਰ ਹੈ, ਜਿਸ ਬਾਰੇ ਬਾਅਦ ਵਿੱਚ ਚਰਚਾ ਕੀਤੀ ਜਾਵੇਗੀ।ਐਨਟੀਆਰ ਕੰਟਰੋਲ ਡੀਐਨਏ ਪ੍ਰਦੂਸ਼ਣ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾਉਣ ਲਈ ਇੱਕ ਜਾਦੂਈ ਸ਼ੀਸ਼ਾ ਹੈ।ਜੇਕਰ ਏਮਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਹੈ, ਤਾਂ ਇਸਦਾ ਮਤਲਬ ਹੈ ਕਿ ਪ੍ਰਦੂਸ਼ਣ ਹੈ।

ਮਿਆਰ
ਸਟੈਂਡਰਡ ਜਾਣੇ-ਪਛਾਣੇ ਇਕਾਗਰਤਾ ਜਾਂ ਕਾਪੀ ਨੰਬਰ ਦੇ ਨਮੂਨੇ ਹਨ ਜੋ ਇੱਕ ਮਿਆਰੀ ਕਰਵ ਬਣਾਉਣ ਲਈ ਵਰਤੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ।ਸਟੈਂਡਰਡ ਦੀ ਸਥਿਰਤਾ ਨੂੰ ਯਕੀਨੀ ਬਣਾਉਣ ਲਈ, ਜੀਨ ਦੇ ਟੁਕੜੇ ਨੂੰ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਪਲਾਜ਼ਮੀਡ ਵਿੱਚ ਕਲੋਨ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਮਿਆਰੀ ਵਜੋਂ ਵਰਤਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।

ਮਿਆਰੀ ਕਰਵ
ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਡਬਲਿੰਗ ਅਨੁਪਾਤ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ ਮਿਆਰੀ ਉਤਪਾਦ ਦੇ ਨਾਲ ਘੱਟੋ-ਘੱਟ 5 ਸੰਘਣਤਾ ਗਰੇਡੀਐਂਟਸ ਵਿੱਚ ਪੇਤਲੀ ਪੈ ਜਾਂਦੀ ਹੈ, ਅਤੇ CT ਮੁੱਲ ਅਤੇ ਕਾਪੀ ਨੰਬਰ ਦੇ ਧੁਰੇ ਵਿੱਚ 5 ਪੁਆਇੰਟ ਬਣਾਏ ਜਾਂਦੇ ਹਨ, ਅਤੇ ਬਿੰਦੂ ਇੱਕ ਸਟੈਂਡਰਡ ਕਰਵ ਬਣਾਉਣ ਲਈ ਇੱਕ ਲਾਈਨ ਬਣਾਉਣ ਲਈ ਜੁੜੇ ਹੁੰਦੇ ਹਨ।ਹਰੇਕ ਸਟੈਂਡਰਡ ਕਰਵ ਲਈ, ਇਸਦੀ ਵੈਧਤਾ ਦੀ ਜਾਂਚ ਕੀਤੀ ਜਾਣੀ ਚਾਹੀਦੀ ਹੈ।ਢਲਾਣ ਦਾ ਮੁੱਲ –3.3 ਅਤੇ –3.8 ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਪੈਂਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਹਰ ਇਕਾਗਰਤਾ ਨੂੰ ਤਿੰਨ ਗੁਣਾਂ ਵਿੱਚ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਜਿਹੜੇ ਬਿੰਦੂ ਦੂਜੇ ਬਿੰਦੂਆਂ ਤੋਂ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ ਵੱਖਰੇ ਹਨ, ਉਨ੍ਹਾਂ ਨੂੰ ਰੱਦ ਕਰ ਦੇਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ।ਟੈਸਟ ਕੀਤੇ ਜਾਣ ਵਾਲੇ ਨਮੂਨੇ ਦੇ CT ਮੁੱਲ ਨੂੰ ਸਟੈਂਡਰਡ ਕਰਵ ਵਿੱਚ ਲਿਆਂਦਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਟੈਸਟ ਕੀਤੇ ਜਾਣ ਵਾਲੇ ਨਮੂਨੇ ਦੇ ਸਮੀਕਰਨ ਪੱਧਰ ਦੀ ਗਣਨਾ ਕੀਤੀ ਜਾ ਸਕਦੀ ਹੈ।

ਟੈਸਟ ਕੀਤੇ ਜਾਣ ਵਾਲੇ ਨਮੂਨੇ ਦੇ CT ਮੁੱਲ ਨੂੰ ਸਟੈਂਡਰਡ ਕਰਵ ਵਿੱਚ ਲਿਆਂਦਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਟੈਸਟ ਕੀਤੇ ਜਾਣ ਵਾਲੇ ਨਮੂਨੇ ਦੀ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਕਾਪੀ ਨੰਬਰ ਦੀ ਗਣਨਾ ਕੀਤੀ ਜਾ ਸਕਦੀ ਹੈ।

ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਅਤੇ ਢਲਾਨ
ਸਟੈਂਡਰਡ ਕਰਵ ਦੀ ਢਲਾਨ ਰੀਅਲ-ਟਾਈਮ ਪੀਸੀਆਰ ਦੀ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੀ ਹੈ।
-3.322 ਦੀ ਢਲਾਣ ਦਰਸਾਉਂਦੀ ਹੈ ਕਿ ਪੀਸੀਆਰ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਕੁਸ਼ਲਤਾ 1, ਜਾਂ 100% ਕੁਸ਼ਲ ਹੈ, ਅਤੇ ਪੀਸੀਆਰ ਉਤਪਾਦ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਹਰੇਕ ਚੱਕਰ ਵਿੱਚ ਦੁੱਗਣੀ ਹੋ ਜਾਂਦੀ ਹੈ।
-3.322 ਤੋਂ ਘੱਟ ਢਲਾਨ (ਜਿਵੇਂ -3.8) ਇੱਕ PCR ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ
· –3.322 (ਉਦਾਹਰਨ ਲਈ, –3.0) ਤੋਂ ਵੱਧ ਢਲਾਨ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਪੀਸੀਆਰ ਕੁਸ਼ਲਤਾ 100% ਤੋਂ ਵੱਧ ਜਾਪਦੀ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ ਉਤਸੁਕ ਹੈ, ਪੀਸੀਆਰ ਦਾ ਇੱਕ ਚੱਕਰ ਵਧੇ ਹੋਏ ਉਤਪਾਦ ਤੋਂ ਦੁੱਗਣਾ ਕਿਵੇਂ ਪੈਦਾ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ?ਇਹ ਸਥਿਤੀ ਪੀਸੀਆਰ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਦੇ ਗੈਰ-ਲੀਨੀਅਰ ਪੜਾਅ ਵਿੱਚ ਵਾਪਰਦੀ ਹੈ, ਯਾਨੀ, ਗੈਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਦੀ ਇੱਕ ਵੱਡੀ ਮਾਤਰਾ ਹੈ.

ਪਿਘਲਣ ਵਾਲੀ ਕਰਵ
qPCR ਐਂਪਲੀਫੀਕੇਸ਼ਨ ਪੂਰਾ ਹੋਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, PCR ਉਤਪਾਦ ਨੂੰ ਗਰਮ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਤਾਪਮਾਨ ਵਧਦਾ ਹੈ, ਡਬਲ-ਸਟ੍ਰੈਂਡਡ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਉਤਪਾਦ ਹੌਲੀ-ਹੌਲੀ ਪਿਘਲ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਦੀ ਤੀਬਰਤਾ ਵਿੱਚ ਕਮੀ ਆਉਂਦੀ ਹੈ।ਜਦੋਂ ਇੱਕ ਨਿਸ਼ਚਿਤ ਤਾਪਮਾਨ (Tm) ਤੱਕ ਪਹੁੰਚ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਤਾਂ ਵੱਡੀ ਗਿਣਤੀ ਵਿੱਚ ਉਤਪਾਦ ਪਿਘਲ ਜਾਣਗੇ।ਫਲੋਰਸੈਂਸ ਤੇਜ਼ੀ ਨਾਲ ਘਟਦਾ ਹੈ।ਵੱਖ-ਵੱਖ PCR ਉਤਪਾਦਾਂ ਦੇ ਵੱਖ-ਵੱਖ Tm ਮੁੱਲ ਅਤੇ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਪਿਘਲਣ ਵਾਲੇ ਤਾਪਮਾਨ ਹੁੰਦੇ ਹਨ, ਤਾਂ ਜੋ PCR ਦੀ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕੀਤੀ ਜਾ ਸਕੇ।

ਪਿਘਲਣ ਵਾਲੀ ਕਰਵ (ਡੈਰੀਵੇਟਿਵ ਕਰਵ)
ਪਿਘਲਣ ਵਾਲੀ ਵਕਰ ਇੱਕ ਚੋਟੀ ਦਾ ਨਕਸ਼ਾ ਬਣਾਉਣ ਲਈ ਲਿਆ ਗਿਆ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ ਪੀਸੀਆਰ ਉਤਪਾਦ ਦੇ ਟੁਕੜਿਆਂ ਦੀ ਸਥਿਤੀ ਨੂੰ ਵਧੇਰੇ ਅਨੁਭਵੀ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਿਤ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਕਿਉਂਕਿ ਪਿਘਲਣ ਦਾ ਤਾਪਮਾਨ DNA ਟੁਕੜੇ ਦਾ Tm ਮੁੱਲ ਹੈ, ਕੁਝ ਮਾਪਦੰਡ ਜੋ DNA ਟੁਕੜੇ ਦੇ Tm ਮੁੱਲ ਨੂੰ ਪ੍ਰਭਾਵਿਤ ਕਰਦੇ ਹਨ, ਦਾ ਨਿਰਣਾ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਟੁਕੜੇ ਦਾ ਆਕਾਰ, GC ਸਮੱਗਰੀ, ਆਦਿ। ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਸਾਡੇ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਸਿਧਾਂਤਾਂ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ,ਐਂਪਲੀਫਾਈਡ ਉਤਪਾਦ ਦੀ ਲੰਬਾਈ 80-300bp ਦੀ ਰੇਂਜ ਵਿੱਚ ਹੈ, ਇਸਲਈ ਪਿਘਲਣ ਦਾ ਤਾਪਮਾਨ 80°C ਅਤੇ 90°C ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਹੋਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ।

ਪਿਘਲਣ ਵਾਲੀ ਕਰਵ ਦੀ ਵਿਆਖਿਆ: ਜੇਕਰ ਸਿਰਫ ਮੁੱਖ ਸਿਖਰ 80°C-90°C ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਦਿਖਾਈ ਦਿੰਦਾ ਹੈ, ਤਾਂ ਇਸਦਾ ਮਤਲਬ ਹੈ ਕਿ ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਮਾਤਰਾਤਮਕ PCR ਸੰਪੂਰਨ ਹੈ;ਜੇਕਰ ਮੁੱਖ ਸਿਖਰ 80°C-90°C ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਦਿਖਾਈ ਦਿੰਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਫੁਟਕਲ ਚੋਟੀਆਂ 80°C ਤੋਂ ਹੇਠਾਂ ਦਿਖਾਈ ਦਿੰਦੀਆਂ ਹਨ, ਤਾਂ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਡਾਇਮਰ ਨੂੰ ਮੂਲ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਮੰਨਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਤੁਸੀਂ ਇਸਨੂੰ ਹੱਲ ਕਰਨ ਲਈ ਐਨੀਲਿੰਗ ਤਾਪਮਾਨ ਨੂੰ ਵਧਾਉਣ ਦੀ ਕੋਸ਼ਿਸ਼ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹੋ;ਜੇਕਰ ਮੁੱਖ ਸਿਖਰ 80°C-90°C ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਦਿਖਾਈ ਦਿੰਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਫੁਟਕਲ ਸਿਖਰ ਮੁੜ ਪ੍ਰਗਟ ਹੁੰਦਾ ਹੈ ਜਦੋਂ ਤਾਪਮਾਨ ਵਧਦਾ ਹੈ, ਇਹ ਮੂਲ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਮੰਨਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਕਿ DNA ਗੰਦਗੀ ਹੈ, ਅਤੇ DNA ਨੂੰ ਤਜਰਬੇ ਦੇ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਪੜਾਅ 'ਤੇ ਹਟਾਉਣ ਦੀ ਲੋੜ ਹੈ।

ਬੇਸ਼ੱਕ, ਅਜੇ ਵੀ ਕੁਝ ਅਸਧਾਰਨ ਸਥਿਤੀਆਂ ਹਨ, ਜੋ ਹੇਠਾਂ ਇੱਕ ਇੱਕ ਕਰਕੇ ਟੁੱਟ ਜਾਣਗੀਆਂ.
3. ਉੱਨਤ ਗਿਆਨ

qPCR ਕਰਨ ਲਈ, ਮੈਨੂੰ MIQE ਕਹਿਣਾ ਪਵੇਗਾ,ਘੱਟੋ-ਘੱਟ ਜਾਣਕਾਰੀਦੇ ਪ੍ਰਕਾਸ਼ਨ ਲਈਮਾਤਰਾਤਮਕਰੀਅਲ-ਟਾਈਮ ਪੀ.ਸੀ.ਆਰਪ੍ਰਯੋਗ — ਅਸਲ-ਸਮੇਂ ਦੀ ਮਾਤਰਾਤਮਕ PCR ਬਾਰੇ ਲੇਖ ਪ੍ਰਕਾਸ਼ਿਤ ਕਰਨ ਲਈ ਘੱਟੋ-ਘੱਟ ਜਾਣਕਾਰੀਤਜਰਬੇਹਰ ਕਿਸੇ ਦੀ ਸਮਝ ਨੂੰ ਸਰਲ ਬਣਾਉਣ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਮੁੱਖ ਸਮੱਗਰੀ ਨੂੰ ਸਰਲ ਬਣਾਵਾਂਗੇ।

ਤੁਸੀਂ ਇੰਟਰਨੈਟ 'ਤੇ MIQE ਦੇ ਅਸਲ ਟੈਕਸਟ ਨੂੰ ਖੋਜ ਸਕਦੇ ਹੋ, ਅਤੇ ਸਭ ਤੋਂ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਗੱਲ ਇਹ ਹੈ ਕਿ ਇਹ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਦਾ ਹੈਡੇਟਾ ਚੈਕਲਿਸਟ ਜੋ ਲੇਖ ਪ੍ਰਕਾਸ਼ਿਤ ਕਰਨ ਵੇਲੇ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕੀਤੀ ਜਾਣੀ ਚਾਹੀਦੀ ਹੈ .

ਸਮੀਖਿਅਕ ਇਹਨਾਂ ਵੇਰਵਿਆਂ ਨੂੰ ਪੜ੍ਹ ਕੇ ਪ੍ਰਯੋਗ ਦੀ ਗੁਣਵੱਤਾ ਦਾ ਨਿਰਣਾ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹਨ;ਭਵਿੱਖ ਦੇ ਪਾਠਕ ਪ੍ਰਯੋਗ ਨੂੰ ਦੁਹਰਾਉਣ ਜਾਂ ਸੁਧਾਰਨ ਲਈ ਵੀ ਇਸਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹਨ।
ਇਹ ਧਿਆਨ ਦੇਣ ਯੋਗ ਹੈ ਕਿ ਇਸ ਸੂਚੀ ਵਿੱਚ, ਹਰੇਕ ਸੂਚੀ ਦੀ ਮਹੱਤਤਾ ਨੂੰ ਕ੍ਰਮਵਾਰ ਈ ਜਾਂ ਡੀ ਨਾਲ ਚਿੰਨ੍ਹਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ.ਇਸਦਾ ਮਤਲੱਬ ਕੀ ਹੈ?E: ਜ਼ਰੂਰੀ ਜਾਣਕਾਰੀ (ਸਪੁਰਦ ਕੀਤੀ ਜਾਣੀ ਚਾਹੀਦੀ ਹੈ);D: ਲੋੜੀਂਦੀ ਜਾਣਕਾਰੀ (ਜਿੰਨਾ ਸੰਭਵ ਹੋ ਸਕੇ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰੋ)।

MIQE (1)-ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਡਿਜ਼ਾਈਨ
ਬਹੁਤ ਸਾਰੇ ਬਦਮਾਸ਼ ਜਿਨ੍ਹਾਂ ਨੇ ਆਪਣੀ ਗ੍ਰੈਜੂਏਟ ਪੜ੍ਹਾਈ ਪੂਰੀ ਕਰਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਆਪਣਾ ਬਚਾਅ ਪੂਰਾ ਕਰ ਲਿਆ ਹੈ, ਉਨ੍ਹਾਂ ਨੂੰ ਇਹ ਨਹੀਂ ਪਤਾ ਹੋਵੇਗਾ ਕਿ ਕਿਵੇਂ ਸੁਤੰਤਰ ਤੌਰ 'ਤੇ ਇੱਕ ਪ੍ਰਯੋਗ ਨੂੰ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਕਰਨਾ ਹੈ, ਆਪਣੀਆਂ ਨੋਟਬੁੱਕਾਂ ਨੂੰ ਖੋਲ੍ਹਣਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਉਹ ਕਰਨਾ ਹੈ ਜੋ ਅਧਿਆਪਕ ਉਨ੍ਹਾਂ ਨੂੰ ਕਰਨ ਲਈ ਕਹਿੰਦਾ ਹੈ।ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ, ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਡਿਜ਼ਾਇਨ ਸਖ਼ਤ ਨਹੀਂ ਸੀ, ਅਤੇ ਮੈਗਜ਼ੀਨ ਦੇ ਸੰਪਾਦਕੀ ਵਿਭਾਗ ਨੇ ਕਿਹਾ ਕਿ ਉਹ ਇਸ ਤਸਵੀਰ ਅਤੇ ਉਸ ਤਸਵੀਰ ਨੂੰ ਬਣਾਉਣਾ ਚਾਹੁੰਦੇ ਸਨ, ਇਸ ਲਈ ਉਨ੍ਹਾਂ ਨੇ ਇਸ ਨੂੰ ਘਬਰਾਹਟ ਵਿੱਚ ਕੀਤਾ।ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ ਬਣਦੇ ਹਨ ਕੂੜਬਾਜ਼!

ਘਰ ਦੇ ਨੇੜੇ, ਪ੍ਰਯੋਗ ਦਾ ਪਹਿਲਾ ਸਿਧਾਂਤ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨਾ ਹੈਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਤਰਕ ਦੀ ਕਠੋਰਤਾ.ਸਭ ਤੋਂ ਬੁਨਿਆਦੀ ਚੀਜ਼ ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਹੈ, ਅਤੇ ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਬਾਰੇ ਸਭ ਤੋਂ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਗੱਲ ਇਹ ਹੈ ਕਿ ਨਿਸ਼ਾਨਾ ਨਮੂਨਾ, ਸੰਦਰਭ ਨਮੂਨਾ (ਨਿਯੰਤਰਣ), ਅਤੇ ਦੁਹਰਾਓ ਦੀ ਸੰਖਿਆ ਨੂੰ ਕਿਵੇਂ ਸੈੱਟ ਕਰਨਾ ਹੈ, ਤਾਂ ਜੋ ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਡੇਟਾ ਨੂੰ ਹਵਾਲਾ, ਤੁਲਨਾਯੋਗ ਅਤੇ ਯਕੀਨਨ ਬਣਾਇਆ ਜਾ ਸਕੇ।

ਟੀਚਾ ਨਮੂਨਾਉਸ ਨਮੂਨੇ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਜਿਸ ਲਈ ਸਾਨੂੰ ਕਿਸੇ ਖਾਸ ਇਲਾਜ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਨਿਸ਼ਾਨਾ ਜੀਨ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾਉਣ ਦੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ।ਹਵਾਲਾ ਨਮੂਨਾਬਿਨਾਂ ਕਿਸੇ ਇਲਾਜ ਦੇ ਨਮੂਨਾ ਹੈ, ਜਿਸ ਨੂੰ ਜੀਵ ਵਿਗਿਆਨ ਵਿੱਚ ਅਕਸਰ ਜੰਗਲੀ ਕਿਸਮ ਕਿਹਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।

ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਤੀਆਂਬਹੁਤ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਹਨ।ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਪ੍ਰੇਰਕ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਤੀਆਂ ਦੀ ਗਿਣਤੀ ਤਿੰਨ ਤੋਂ ਵੱਧ ਹੋਣੀ ਚਾਹੀਦੀ ਹੈ।ਇਹ ਵੱਖਰਾ ਕਰਨਾ ਜ਼ਰੂਰੀ ਹੈ ਕਿ ਜੈਵਿਕ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਤੀ ਕੀ ਹੈ ਅਤੇ ਤਕਨੀਕੀ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਤੀ ਕੀ ਹੈ।

ਜੀਵ-ਵਿਗਿਆਨਕ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਤੀਆਂ: ਵੱਖ-ਵੱਖ ਸਮੱਗਰੀਆਂ (ਸਮਾਂ, ਪੌਦਿਆਂ, ਬੈਚਾਂ, ਪ੍ਰਤੀਕਿਰਿਆ ਪਲੇਟਾਂ) ਨਾਲ ਕੀਤੇ ਗਏ ਇੱਕੋ ਤਸਦੀਕ ਪ੍ਰਯੋਗ।

ਜੀਵ-ਵਿਗਿਆਨਕ ਨਕਲ
ਆਓ ਮਿਰਚ ਦੇ ਕੀਟਨਾਸ਼ਕ ਇਲਾਜ ਨੂੰ ਇੱਕ ਉਦਾਹਰਣ ਵਜੋਂ ਲੈਂਦੇ ਹਾਂ।ਅਸੀਂ ABC ਦੇ ਤਿੰਨ ਪੌਦਿਆਂ 'ਤੇ ਕੀਟਨਾਸ਼ਕਾਂ ਦਾ ਛਿੜਕਾਅ ਕਰਨਾ ਚਾਹੁੰਦੇ ਹਾਂ, ਫਿਰ ABC ਦੇ ਤਿੰਨ ਪੌਦੇ ਤਿੰਨ ਜੈਵਿਕ ਪ੍ਰਤੀਰੂਪ ਹਨ, ਅਤੇ ਇਹ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਸਮੱਗਰੀਆਂ ਨਾਲ ਕੀਤੇ ਗਏ ਇੱਕੋ ਤਸਦੀਕ ਪ੍ਰਯੋਗ ਹਨ।ਪਰ ਇੱਕ ਪ੍ਰਯੋਗ ਦੇ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਇੱਕ ਨਿਯੰਤਰਣ ਦੀ ਜਰੂਰਤ ਹੈ, ਇਸਲਈ ਅਸੀਂ ਪੌਦੇ A ਦੇ ਇੱਕ ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਸਮੂਹ ਨੂੰ ਬਣਾਉਣ ਲਈ ਪੌਦੇ A ਦੀਆਂ ਸ਼ਾਖਾਵਾਂ ਵਿੱਚੋਂ ਇੱਕ ਨੂੰ ਸਪਰੇਅ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹਾਂ, ਅਤੇ ਇੱਕ ਨਿਯੰਤਰਣ ਸਮੂਹ ਬਣਾਉਣ ਲਈ ਪੌਦੇ A ਦੀਆਂ ਦੂਜੀਆਂ ਸ਼ਾਖਾਵਾਂ ਦਾ ਛਿੜਕਾਅ ਨਹੀਂ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹਾਂ।ਬੀ ਅਤੇ ਸੀ ਲਈ ਵੀ ਅਜਿਹਾ ਹੀ ਕਰੋ।

ਤਕਨੀਕੀ ਨਕਲ (ਤਕਨੀਕੀ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਤੀਆਂ): ਇਹ ਇੱਕ ਵਾਰ-ਵਾਰ ਪ੍ਰਯੋਗ ਹੈ ਜੋ ਓਪਰੇਸ਼ਨ ਕਾਰਨ ਹੋਣ ਵਾਲੀਆਂ ਗਲਤੀਆਂ ਤੋਂ ਬਚਣ ਲਈ ਤਿਆਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ, ਜੋ ਅਸਲ ਵਿੱਚ ਉਸੇ ਸਮੱਗਰੀ ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ ਇੱਕ ਡੁਪਲੀਕੇਟ ਮੋਰੀ ਹੈ।ਦੋਵਾਂ ਇਲਾਜਾਂ ਅਤੇ ਨਿਯੰਤਰਣਾਂ ਵਿੱਚ ਨਿਸ਼ਾਨਾ ਜੀਨ ਅਤੇ ਅੰਦਰੂਨੀ ਸੰਦਰਭ ਜੀਨ ਦੀਆਂ ਪ੍ਰਤੀਰੂਪ ਸੈਟਿੰਗਾਂ (ਘੱਟੋ-ਘੱਟ ਤਿੰਨ) ਹੋਣੀਆਂ ਚਾਹੀਦੀਆਂ ਹਨ।

ਤਕਨੀਕੀ ਦੁਹਰਾਓ
ਕੀਟਨਾਸ਼ਕਾਂ ਨਾਲ ਇਲਾਜ ਕੀਤੀ ਮਿਰਚ ਨੂੰ ਦੁਬਾਰਾ ਉਦਾਹਰਣ ਵਜੋਂ ਲਓ।ਪਲਾਂਟ ਏ ਦੇ ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਸਮੂਹ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਇਸਦੇ ਟੀਚੇ ਵਾਲੇ ਜੀਨ ਅਤੇ ਅੰਦਰੂਨੀ ਸੰਦਰਭ ਜੀਨ ਲਈ ਕ੍ਰਮਵਾਰ 1, 2, ਅਤੇ 3 ਦੇ ਤਿੰਨ ਪੀਸੀਆਰ ਛੇਕ ਬਣਾਏ, ਤਾਂ ਜੋ ਖੋਜ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਔਸਤ ਲਿਆ ਜਾ ਸਕੇ।ਪੌਦੇ ਦੇ ਨਿਯੰਤਰਣ ਲਈ ਏ ਸਮੂਹਾਂ ਦਾ ਵੀ ਇਸੇ ਤਰ੍ਹਾਂ ਇਲਾਜ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਇਸੇ ਤਰ੍ਹਾਂ ਬੀ ਅਤੇ ਸੀ ਪੌਦਿਆਂ ਦਾ ਵੀ ਇਹੀ ਇਲਾਜ ਕਰੋ।ਇਹ ਤਕਨੀਕੀ ਦੁਹਰਾਓ ਹੈ।

ਇਹ ਧਿਆਨ ਦੇਣ ਯੋਗ ਹੈ ਕਿਅੰਕੜਿਆਂ ਵਿੱਚ ਜੋ ਪ੍ਰਵੇਸ਼ ਕਰਦਾ ਹੈ ਉਹ ਜੀਵ-ਵਿਗਿਆਨਕ ਦੁਹਰਾਓ ਹੈ, ਅਤੇ ਤਕਨੀਕੀ ਦੁਹਰਾਓ ਇਹ ਜਾਂਚ ਕਰਨਾ ਹੈ ਕਿ ਕੀ ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਵਿੱਚ ਕੋਈ ਬੇਤਰਤੀਬ ਵਰਤਾਰੇ ਹਨ, ਤਾਂ ਜੋ ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਨਤੀਜਿਆਂ ਨੂੰ ਭਰੋਸੇਯੋਗ ਬਣਾਇਆ ਜਾ ਸਕੇ, ਯਾਨੀ ਉਹਨਾਂ ਦੀ ਔਸਤ ਨੂੰ ਲੈ ਕੇ ਗਲਤੀਆਂ ਤੋਂ ਬਚਿਆ ਜਾ ਸਕੇ ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਅਸੀਂ ਅਕਸਰ ਕਹਿੰਦੇ ਹਾਂ।

ਨਕਾਰਾਤਮਕ ਨਿਯੰਤਰਣ - NTC ਅਤੇ NRT
NTC (ਨੋ-ਟੈਂਪਲੇਟ ਕੰਟਰੋਲ), ਇੱਕ ਟੈਂਪਲੇਟ ਤੋਂ ਬਿਨਾਂ ਇੱਕ ਨਿਯੰਤਰਣ, ਇਹ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕਰਨ ਲਈ ਵਰਤਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਕੀ ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਸਮੱਗਰੀ ਦੂਸ਼ਿਤ ਹੈ।ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਪਾਣੀ ਨੂੰ ਨਮੂਨੇ ਵਜੋਂ ਵਰਤਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ.ਜੇ ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਹੁੰਦੀ ਹੈ, ਤਾਂ ਇਹ ਸੰਕੇਤ ਦਿੰਦਾ ਹੈ ਕਿ ਪ੍ਰਯੋਗਸ਼ਾਲਾ ਵਿੱਚ ਨਿਊਕਲੀਕ ਐਸਿਡ ਦੀ ਗੰਦਗੀ ਹੋਈ ਹੈ।

ਇਹ ਪ੍ਰਦੂਸ਼ਣ ਇਸ ਤੋਂ ਆਉਂਦੇ ਹਨ: ਅਸ਼ੁੱਧ ਪਾਣੀ, ਐਂਡੋਜੇਨਸ ਡੀਐਨਏ ਵਾਲੇ ਅਯੋਗ ਰੀਐਜੈਂਟਸ, ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਪ੍ਰਦੂਸ਼ਣ, ਪ੍ਰਯੋਗਸ਼ਾਲਾ ਦੇ ਉਪਕਰਣਾਂ ਦਾ ਪ੍ਰਦੂਸ਼ਣ, ਐਰੋਸੋਲ ਪ੍ਰਦੂਸ਼ਣ, ਆਦਿ, ਨੂੰ RNase scavengers ਅਤੇ RNase ਇਨਿਹਿਬਟਰਸ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਨ ਦੀ ਲੋੜ ਹੈ।ਐਰੋਸੋਲ ਪ੍ਰਦੂਸ਼ਣ ਨੂੰ ਲੱਭਣਾ ਸਭ ਤੋਂ ਮੁਸ਼ਕਲ ਹੈ.ਕਲਪਨਾ ਕਰੋ ਕਿ ਤੁਹਾਡੀ ਪ੍ਰਯੋਗਸ਼ਾਲਾ ਧੁੰਦ ਵਰਗੀ ਹੈ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਹਵਾ ਵਿੱਚ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਨਿਊਕਲੀਕ ਐਸਿਡ ਮੁਅੱਤਲ ਹਨ।

NRT (ਨੋ-ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟੇਜ), ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਤੋਂ ਬਿਨਾਂ ਨਿਯੰਤਰਣ, ਇੱਕ ਨਕਾਰਾਤਮਕ ਨਿਯੰਤਰਣ ਵਜੋਂ ਗੈਰ-ਉਲਟਾ ਪ੍ਰਤੀਲਿਪੀ RNA ਹੈ, ਜੋ ਕਿ gDNA ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਦਾ ਨਿਯੰਤਰਣ ਹੈ।

ਜੀਨ ਸਮੀਕਰਨ ਕਰਦੇ ਸਮੇਂ, ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਸੀਡੀਐਨਏ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾ ਕੇ ਆਰਐਨਏ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾਇਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਜੇ ਆਰਐਨਏ ਨੂੰ ਸ਼ੁੱਧ ਕਰਨ ਵੇਲੇ ਜੀਡੀਐਨਏ ਦੀ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਹੁੰਦੀ ਹੈ, ਤਾਂ ਇਹ ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਨਤੀਜਿਆਂ ਵਿੱਚ ਤਰੁੱਟੀਆਂ ਪੈਦਾ ਕਰੇਗੀ, ਕਿਉਂਕਿ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੇ ਅਸਲ ਨਤੀਜੇ ਜੀਡੀਐਨਏ ਅਤੇ ਸੀਡੀਐਨਏ ਹਨ।ਸਮੁੱਚੇ ਪੱਧਰ 'ਤੇ, ਨਾ ਸਿਰਫ਼ cDNA, gDNA ਨੂੰ RNA ਕੱਢਣ ਦੌਰਾਨ ਪੂਰੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਹਟਾਉਣ ਦੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ।

MIQE (2)-ਨਮੂਨਾ ਜਾਣਕਾਰੀ
ਅਖੌਤੀ ਨਮੂਨਾ ਜਾਣਕਾਰੀ ਦਾ ਮਤਲਬ ਹੈ ਕਿ ਜਦੋਂ ਅਸੀਂ qPCR ਬਾਰੇ ਕੋਈ ਲੇਖ ਪ੍ਰਕਾਸ਼ਿਤ ਕਰਦੇ ਹਾਂ, ਤਾਂ ਸਾਨੂੰ ਨਮੂਨਾ ਜਾਣਕਾਰੀ ਨੂੰ ਸਪਸ਼ਟ ਤੌਰ 'ਤੇ ਸਮਝਾਉਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ ਲੇਖ ਦਾ ਇੱਕ ਲਾਜ਼ਮੀ ਹਿੱਸਾ ਹੈ।ਇਸੇ ਤਰ੍ਹਾਂ, ਜਦੋਂ ਅਸੀਂ ਨਮੂਨਿਆਂ ਦੀ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਕਰਦੇ ਹਾਂ, ਸਾਨੂੰ ਨਮੂਨਿਆਂ ਦੀ ਵੈਧਤਾ ਨੂੰ ਯਕੀਨੀ ਬਣਾਉਣ ਲਈ ਆਪਣੇ ਆਪਰੇਸ਼ਨਾਂ ਨੂੰ ਵੀ ਨਿਯੰਤ੍ਰਿਤ ਕਰਨਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ।

ਨਮੂਨੇ ਦਾ ਵਰਣਨ ਸਿਰਫ ਇੱਕ ਨਤੀਜਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਸਾਨੂੰ ਪੂਰੇ ਪ੍ਰਯੋਗ ਦੇ ਦੌਰਾਨ ਲਈਆਂ ਗਈਆਂ ਸਮੱਗਰੀਆਂ 'ਤੇ ਵਧੇਰੇ ਧਿਆਨ ਦੇਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ।

ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਸਮੱਗਰੀ ਦੀ ਚੋਣ
ਖੂਨ ਦੇ ਨਮੂਨੇ - ਤਾਜ਼ੇ ਖੂਨ ਦੀ ਚੋਣ ਕਰੋ, 4 ਘੰਟਿਆਂ ਤੋਂ ਵੱਧ ਨਹੀਂ।ਸੈੱਲ ਦੇ ਨਮੂਨੇ - ਜ਼ੋਰਦਾਰ ਵਿਕਾਸ ਦੀ ਮਿਆਦ ਵਿੱਚ ਤਾਜ਼ੇ ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਇਕੱਠਾ ਕਰਨ ਦੀ ਚੋਣ ਕਰੋ।ਐਨੀਮਲ ਟਿਸ਼ੂ - ਤਾਜ਼ੇ, ਜ਼ੋਰਦਾਰ ਵਧ ਰਹੇ ਟਿਸ਼ੂ ਦੀ ਚੋਣ ਕਰੋ।ਪੌਦੇ ਦੇ ਟਿਸ਼ੂ - ਤਾਜ਼ੇ, ਜਵਾਨ ਟਿਸ਼ੂ ਦੀ ਚੋਣ ਕਰੋ।

ਤੁਸੀਂ ਧਿਆਨ ਦਿੱਤਾ ਹੋਵੇਗਾ ਕਿ ਇਹਨਾਂ ਕੁਝ ਵਾਕਾਂ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਮੁੱਖ ਸ਼ਬਦ ਹੈ: fresh .
ਉਪਰੋਕਤ ਨਮੂਨਿਆਂ ਲਈ, ਮਾਰਕੀਟ ਵਿੱਚ ਸਭ ਤੋਂ ਵਧੀਆ, ਲਾਗਤ-ਪ੍ਰਭਾਵਸ਼ਾਲੀ ਅਤੇ ਸਥਿਰ ਕਿੱਟ ਫੋਰਜੀਨ ਦੀ ਕਿੱਟ ਹੈ, ਜੋ ਉਹਨਾਂ ਦੇ ਡੀਐਨਏ ਅਤੇ ਆਰਐਨਏ ਨੂੰ ਜਲਦੀ ਅਤੇ ਆਸਾਨੀ ਨਾਲ ਕੱਢ ਸਕਦੀ ਹੈ।

ਬਲੱਡ ਡੀਐਨਏ ਮਿੰਨੀ ਕਿੱਟ

ਸੈੱਲ ਕੁੱਲ RNA ਆਈਸੋਲੇਸ਼ਨ ਕਿੱਟ

ਜਾਨਵਰਾਂ ਦੀ ਕੁੱਲ RNA ਆਈਸੋਲੇਸ਼ਨ ਕਿੱਟ

ਪਲਾਂਟ ਕੁੱਲ RNA ਆਈਸੋਲੇਸ਼ਨ ਕਿੱਟ

ਪਲਾਂਟ ਟੋਟਲ ਆਰਐਨਏ ਆਈਸੋਲੇਸ਼ਨ ਕਿੱਟ ਪਲੱਸ

ਪਲਾਂਟ ਡੀਐਨਏ ਆਈਸੋਲੇਸ਼ਨ ਕਿੱਟ

ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਸਮੱਗਰੀ ਦੀ ਸਟੋਰੇਜ
ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਅਸੀਂ ਨਮੂਨੇ ਸਟੋਰ ਕਰਨ ਦੀ ਸਿਫ਼ਾਰਸ਼ ਨਹੀਂ ਕਰਦੇ, ਜੇ ਹਾਲਾਤ ਇਜਾਜ਼ਤ ਦਿੰਦੇ ਹਨ।ਹਾਲਾਂਕਿ, ਬਹੁਤ ਸਾਰੇ ਦੋਸਤ ਅਜਿਹੇ ਹਨ ਜੋ ਨਮੂਨੇ ਲੈਣ ਤੋਂ ਤੁਰੰਤ ਬਾਅਦ ਪ੍ਰਯੋਗ ਨਹੀਂ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹਨ, ਅਤੇ ਕੁਝ ਨੂੰ ਨਮੂਨੇ ਲੈਣ ਲਈ ਤਰਲ ਨਾਈਟ੍ਰੋਜਨ ਟੈਂਕਾਂ ਨੂੰ ਖੇਤ ਵਿੱਚ ਲਿਜਾਣ ਦੀ ਵੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ।

ਇਸ ਕਿਸਮ ਦੇ ਮਿਹਨਤੀ ਦੋਸਤ ਲਈ, ਮੈਂ ਸਿਰਫ ਇਹ ਕਹਿ ਸਕਦਾ ਹਾਂ ਕਿ ਤੁਸੀਂ ਰੀਐਜੈਂਟ ਖਪਤਕਾਰਾਂ ਨੂੰ ਨਹੀਂ ਸਮਝਦੇ.ਹੁਣ ਬਹੁਤ ਸਾਰੀਆਂ ਰੀਐਜੈਂਟ ਖਪਤਯੋਗ ਕੰਪਨੀਆਂ ਰੀਐਜੈਂਟ ਤਿਆਰ ਕਰਦੀਆਂ ਹਨ ਜੋ ਕਮਰੇ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ ਆਰਐਨਏ ਨਮੂਨੇ ਸਟੋਰ ਕਰ ਸਕਦੀਆਂ ਹਨ, ਅਤੇ ਤੁਸੀਂ ਉਹਨਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਨ ਦੀ ਚੋਣ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹੋ।ਪਰੰਪਰਾਗਤ ਸਟੋਰੇਜ ਵਿਧੀ ਤਰਲ ਨਾਈਟ੍ਰੋਜਨ ਸਟੋਰੇਜ ਹੈ, ਇੱਕ ਛੋਟੇ ਤਰਲ ਨਾਈਟ੍ਰੋਜਨ ਟੈਂਕ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਜੋ ਲਿਜਾਣਾ ਆਸਾਨ ਹੈ।ਨਮੂਨੇ ਨੂੰ ਪ੍ਰਯੋਗਸ਼ਾਲਾ ਵਿੱਚ ਵਾਪਸ ਲਿਆਉਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਇਸਨੂੰ -80 ਡਿਗਰੀ ਸੈਲਸੀਅਸ ਫਰਿੱਜ ਵਿੱਚ ਸਟੋਰ ਕਰੋ।

RNA ਨੂੰ ਸ਼ਾਮਲ ਕਰਨ ਵਾਲੇ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਲਈ, ਛੇ-ਸ਼ਬਦਾਂ ਦੇ ਸਿਧਾਂਤ ਦੀ ਪਾਲਣਾ ਕੀਤੀ ਜਾਣੀ ਚਾਹੀਦੀ ਹੈ:ਘੱਟ ਤਾਪਮਾਨ, ਕੋਈ ਐਨਜ਼ਾਈਮ ਨਹੀਂ,ਅਤੇਤੇਜ਼ .

ਘੱਟ ਤਾਪਮਾਨ ਦੀ ਧਾਰਨਾ ਨੂੰ ਸਮਝਣਾ ਆਸਾਨ ਹੈ;ਐਨਜ਼ਾਈਮਾਂ ਤੋਂ ਬਿਨਾਂ, RNase ਸੰਸਾਰ ਵਿੱਚ ਹਰ ਥਾਂ ਹੈ ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਅਸੀਂ ਰਹਿੰਦੇ ਹਾਂ (ਨਹੀਂ ਤਾਂ ਤੁਸੀਂ ਐੱਚਆਈਵੀ ਦੁਆਰਾ ਮਾਰੇ ਗਏ ਹੁੰਦੇ), ਇਸ ਲਈ ਪ੍ਰਯੋਗ ਕਰਦੇ ਸਮੇਂ RNase ਤੋਂ ਕਿਵੇਂ ਬਚਣਾ ਹੈ ਇੱਕ ਬਹੁਤ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਸੰਕਲਪ ਹੈ;ਤੇਜ਼,ਦੁਨੀਆ ਵਿਚ ਕੋਈ ਕੁੰਗ ਫੂ ਨਹੀਂ ਹੈ ਜਿਸ ਨੂੰ ਤੋੜਿਆ ਨਹੀਂ ਜਾ ਸਕਦਾ, ਸਿਰਫ ਗਤੀ ਨੂੰ ਤੋੜਿਆ ਨਹੀਂ ਜਾ ਸਕਦਾ.

ਇਸ ਲਈ, ਇੱਕ ਅਰਥ ਵਿੱਚ, ਕੱਢਣ ਦਾ ਸਮਾਂ ਜਿੰਨਾ ਛੋਟਾ ਹੋਵੇਗਾ, ਕਿੱਟ ਓਨੀ ਹੀ ਵਧੀਆ ਹੋਵੇਗੀ।ਕਿਉਂ ਕਰਦਾ ਹੈਫੋਰਜੀਨਦੀ ਕਿੱਟ ਗਤੀ 'ਤੇ ਜ਼ੋਰ ਦਿੰਦੀ ਹੈ, ਕਿਉਂਕਿ ਉਹ ਇਸ ਨੂੰ ਚੰਗੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਜਾਣਦੇ ਹਨ।

PS: ਕੁਝ ਕੁੜੀਆਂ ਬਹੁਤ ਧਿਆਨ ਨਾਲ ਪ੍ਰਯੋਗ ਕਰਦੀਆਂ ਹਨ, ਪਰ ਉਹ ਕਈ ਸਾਲਾਂ ਦੇ ਕੰਮ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਸਲੈਮ ਡੰਕ ਵਾਂਗ ਵਧੀਆ ਨਹੀਂ ਹੁੰਦੀਆਂ ਹਨ।ਉਹ ਮਹਿਸੂਸ ਕਰਦੇ ਹਨ ਕਿ ਪਰਮੇਸ਼ੁਰ ਬੇਇਨਸਾਫ਼ੀ ਹੈ, ਦੂਜਿਆਂ ਬਾਰੇ ਸ਼ਿਕਾਇਤ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਜ਼ਿੰਦਗੀ ਦੀ ਭਾਲ ਕਰਦਾ ਹੈ।ਅਸਲ ਵਿੱਚ, ਉਸ ਨੂੰ ਇਹ ਸਮਝ ਨਹੀਂ ਆਈ।ਉਸਨੇ ਆਰਐਨਏ ਦੀ ਚੰਗੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਸੁਰੱਖਿਆ ਨਹੀਂ ਕੀਤੀ, ਅਤੇ ਸਲੈਮ ਡੰਕ ਪਲੇਅਰ ਚੁਸਤ ਸੀ।ਜਦੋਂ ਉਹ ਪ੍ਰਯੋਗ ਕਰ ਰਿਹਾ ਸੀ, ਉਸਨੇ ਸੋਚਿਆ ਕਿ ਉਹ ਸਲੈਮ ਡੰਕ ਨੂੰ ਤਿੰਨ ਵਾਰ, ਪੰਜ ਵਾਰ ਅਤੇ ਦੋ ਭਾਗਾਂ ਨਾਲ ਖਤਮ ਕਰ ਦੇਵੇਗਾ, ਪਰ ਉਸਨੇ ਪ੍ਰਯੋਗ ਨੂੰ ਚੰਗੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਕੀਤਾ।

ਨੋਟ ਕਰੋ: ਹੌਲੀ, RNase ਦੇ ਹਮਲੇ ਦੀ ਵਧੇਰੇ ਸੰਭਾਵਨਾ।ਆਪਣੇ ਆਪ ਨੂੰ ਤੇਜ਼ ਹੋਣ ਲਈ ਕਿਵੇਂ ਸਿਖਲਾਈ ਦੇਣੀ ਹੈ?ਕੋਈ ਤਰੀਕਾ ਨਹੀਂ ਹੈ, ਬੱਸ ਹੋਰ ਅਭਿਆਸ ਕਰੋ।

ਵੱਖ-ਵੱਖ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਅਤੇ ਵੱਖੋ-ਵੱਖਰੇ ਨਮੂਨਿਆਂ ਲਈ, ਅਜੇ ਵੀ ਹੋਰ ਸਾਹਿਤ ਨੂੰ ਪੜ੍ਹਨਾ ਅਤੇ ਪ੍ਰੋਸੈਸਿੰਗ ਲਈ ਇੱਕ ਢੁਕਵੀਂ ਵਿਧੀ ਚੁਣਨਾ ਜ਼ਰੂਰੀ ਹੈ।ਨਮੂਨਾ ਇਕੱਠਾ ਕਰਨ ਅਤੇ ਸਟੋਰੇਜ ਦੀ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਲਈ, MIQE ਦੀ ਲੋੜ ਹੈ ਕਿ ਇਹ ਕਾਗਜ਼ ਵਿੱਚ ਸਪੱਸ਼ਟ ਤੌਰ 'ਤੇ ਲਿਖਿਆ ਜਾਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ, ਤਾਂ ਜੋ ਸਮੀਖਿਅਕ ਕਾਗਜ਼ ਦੀ ਭਰੋਸੇਯੋਗਤਾ ਦੀ ਸਮੀਖਿਆ ਕਰ ਸਕਣ, ਅਤੇ ਹੈਰਾਨ ਹੋਏ ਨੌਜਵਾਨਾਂ ਲਈ ਤੁਹਾਡੇ ਪ੍ਰਯੋਗ ਨੂੰ ਦੁਹਰਾਉਣਾ ਵੀ ਸੁਵਿਧਾਜਨਕ ਹੈ।

ਹਾਲਾਂਕਿ ਜੀਵ-ਵਿਗਿਆਨਕ ਪ੍ਰਯੋਗ ਮੁਸ਼ਕਲ ਹਨ, ਪਰ ਉਹ ਉੱਚ ਪੱਧਰੀ ਹਨ।ਜੇ ਤੁਸੀਂ ਸਾਵਧਾਨ ਨਹੀਂ ਹੋ, ਤਾਂ ਤੁਸੀਂ ਦੁਨੀਆ ਨੂੰ ਉਲਟਾ ਸਕਦੇ ਹੋ.ਉਦਾਹਰਨ ਲਈ, ਸਾਰਸ ਨੂੰ ਬਾਇਓਕੈਮੀਕਲ ਸੰਕਟ ਵਿੱਚ ਬਦਲਣਾ, ਜਾਂ 1.3 ਬਿਲੀਅਨ ਲੋਕਾਂ ਨੂੰ ਬਚਾਉਣ ਲਈ ਹਾਈਬ੍ਰਿਡ ਚਾਵਲ ਬਣਾਉਣਾ।ਹੇਠਾਂ ਦਿੱਤੀ ਤਸਵੀਰ ਇੱਕ ਰਸਾਇਣਕ ਪ੍ਰਯੋਗ ਹੈ, ਤੁਹਾਨੂੰ ਉਸਦੀ ਡਿਕ ਵਰਗੀ ਦਿੱਖ ਨੂੰ ਦੇਖ ਕੇ ਸਮਝਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ ਕਿ ਤੁਸੀਂ ਆਪਣੀ ਖੋਜ 'ਤੇ ਕਿੰਨਾ ਮਾਣ ਮਹਿਸੂਸ ਕਰਦੇ ਹੋ।ਇਸਨੂੰ ਭੁੱਲ ਜਾਓ, ਉਸਨੂੰ ਕਾਲਾ ਨਾ ਕਰੋ.

MIQE (3) - ਨਿਊਕਲੀਕ ਐਸਿਡ ਕੱਢਣਾ।
ਨਿਊਕਲੀਕ ਐਸਿਡ ਕੱਢਣਾ ਇੱਕ ਵੱਡੀ ਘਟਨਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਸਾਰੇ ਅਣੂ ਜੀਵ ਵਿਗਿਆਨ ਪ੍ਰਯੋਗ ਨਿਊਕਲੀਕ ਐਸਿਡ ਕੱਢਣ ਨਾਲ ਸ਼ੁਰੂ ਹੁੰਦੇ ਹਨ।ਸਭ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ, ਆਓ ਨਿਊਕਲੀਕ ਐਸਿਡ ਕੱਢਣ 'ਤੇ MIQE ਦੀ ਸਮੱਗਰੀ ਦੀ ਨਕਲ ਕਰੀਏ।

ਇਸ ਫਾਰਮ ਨੂੰ ਦੇਖਦੇ ਹੋਏ, ਤੁਸੀਂ ਸਤ੍ਹਾ 'ਤੇ ਨਹੀਂ ਰਹਿ ਸਕਦੇ.ਰੂਪ ਇੱਕ ਮਤ ਹੈ।ਇੱਕ ਚੋਟੀ ਦਾ ਵਿਦਿਆਰਥੀ ਬਣਨ ਲਈ, ਤੁਹਾਨੂੰ ਇਹ ਪੁੱਛਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ ਕਿ ਕਿਉਂ.ਇਸ ਸਾਰਣੀ ਦੀ ਜ਼ਰੂਰੀ ਸਮੱਗਰੀ ਹੈ: ਪਿੱਛਾ ਕਰੋਆਰਐਨਏ ਦੀ ਸ਼ੁੱਧਤਾ, ਇਕਸਾਰਤਾ, ਇਕਸਾਰਤਾ ਅਤੇ ਕੱਢਣ ਦੀ ਮਾਤਰਾ .

ਦਾ ਪਹਿਲਾ ਹਿੱਸਾਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਜਾਂ ਸਾਧਨ ਨਿਊਕਲੀਕ ਐਸਿਡ ਕੱਢਣ ਦਾ ਪੜਾਅ ਹੈ।ਜੇਕਰ ਤੁਸੀਂ ਐਕਸਟਰੈਕਟ ਕਰਨ ਲਈ ਇੱਕ ਆਟੋਮੈਟਿਕ ਨਿਊਕਲੀਕ ਐਸਿਡ ਐਕਸਟਰੈਕਟਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋ (ਐਡਵਾਂਸਡ, ਕਿਰਪਾ ਕਰਕੇ ਖਰੀਦ ਲਈ ਮੇਰੇ ਨਾਲ ਸੰਪਰਕ ਕਰੋ), ਤੁਹਾਨੂੰ ਯੰਤਰ ਦਾ ਮਾਡਲ ਨਾਮ ਦਰਸਾਉਣ ਦੀ ਲੋੜ ਹੈ।

ਕਿੱਟ ਦਾ ਨਾਮ ਅਤੇ

ਪਰਿਵਰਤਨ ਵੇਰਵਿਆਂ ਲਈ ਕਿਹੜੀ ਕਿੱਟ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ, ਕਿਹੜੇ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਰੀਐਜੈਂਟਸ ਸ਼ਾਮਲ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ ਜਾਂ ਕਿਹੜੇ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਓਪਰੇਸ਼ਨ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ, ਇਸ ਬਾਰੇ ਸਪਸ਼ਟ ਤੌਰ 'ਤੇ ਵਿਆਖਿਆ ਕੀਤੀ ਜਾਣੀ ਚਾਹੀਦੀ ਹੈ ਤਾਂ ਜੋ ਦੂਜੇ ਤੁਹਾਡੇ ਪ੍ਰਯੋਗ ਨੂੰ ਆਸਾਨੀ ਨਾਲ ਦੁਹਰਾ ਸਕਣ।

ਕੁਝ ਲੋਕ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਨਮੂਨੇ ਕੱਢਣ ਵੇਲੇ ਕੁਝ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਰੀਐਜੈਂਟਸ ਜੋੜਦੇ ਹਨ, ਇਹ ਸੋਚਦੇ ਹੋਏ ਕਿ ਇਹ ਉਨ੍ਹਾਂ ਦਾ ਗੁਪਤ ਹਥਿਆਰ ਹੈ ਅਤੇ ਦੂਜਿਆਂ ਨੂੰ ਨਾ ਦੱਸੋ।ਇਸ ਨੂੰ ਗੁਪਤ ਰੱਖਦੇ ਹੋਏ, ਉਹ ਤੁਹਾਡੇ ਲੇਖ ਨੂੰ ਚਮਕਦਾਰ ਬਣਾਉਣ ਦਾ ਮੌਕਾ ਵੀ ਗੁਆ ਦਿੰਦੇ ਹਨ।ਹੁਸ਼ਿਆਰ ਨਾ ਬਣੋ, ਤੁਹਾਨੂੰ ਵਿਗਿਆਨਕ ਖੋਜ ਵਿੱਚ ਦੇਸ਼ ਦੇ ਪੁਰਾਣੇ ਝਾਂਗ ਨਾਲੋਂ ਜ਼ਿਆਦਾ ਇਮਾਨਦਾਰ ਹੋਣਾ ਪਵੇਗਾ, ਜੇ ਤੁਸੀਂ ਹੁਸ਼ਿਆਰ ਬਣਨਾ ਚਾਹੁੰਦੇ ਹੋ, ਤਾਂ ਲੇਖ ਤੁਹਾਨੂੰ ਮੂਰਖ ਬਣਾ ਦੇਵੇਗਾ.

ਕਿੱਟ ਦਾ ਉਤਪਾਦ ਨੰਬਰ ਯਾਦ ਰੱਖਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈਜਦੋਂ ਤੁਸੀਂ ਕਿੱਟ ਆਰਡਰ ਕਰਦੇ ਹੋ ਅਤੇ ਲੇਖ ਲਿਖਦੇ ਹੋ।ਕਿੱਟ 'ਤੇ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਦੋ ਨੰਬਰ ਹੁੰਦੇ ਹਨ: ਕੈਟ—ਕੈਟਲਾਗ ਨੰਬਰ (ਉਤਪਾਦ ਨੰਬਰ, ਲੇਖ ਨੰਬਰ), ਲਾਟ—ਉਤਪਾਦ ਲਾਟ ਨੰਬਰ (ਇਹ ਦਰਸਾਉਣ ਲਈ ਵਰਤਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਉਤਪਾਦ ਕਿਸ ਬੈਚ ਤੋਂ ਆਇਆ ਹੈ)।

ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਬਾਇਓਕੈਮੀਕਲ ਰੀਐਜੈਂਟਸ ਨੂੰ ਆਰਡਰ ਕਰਨ ਵੇਲੇ CAS ਨੰਬਰ ਅਕਸਰ ਵਰਤਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਮੈਂ ਇਸਨੂੰ ਇਕੱਠੇ ਪ੍ਰਸਿੱਧ ਕਰਾਂਗਾ।CAS ਨੰਬਰ ਅਮਰੀਕਨ ਕੈਮੀਕਲ ਸੋਸਾਇਟੀ ਦੁਆਰਾ ਹਰੇਕ ਨਵੀਂ ਰਸਾਇਣਕ ਦਵਾਈ ਨੂੰ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਨੰਬਰ ਹੈ।ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਤਿੰਨ ਨੰਬਰ ਇੱਕ ਡੈਸ਼ ਦੁਆਰਾ ਜੁੜੇ ਹੁੰਦੇ ਹਨ।ਰੁਸ਼ੂਈ ਦਾ CAS ਨੰਬਰ: 7732-18-5।ਰਸਾਇਣਾਂ ਦੇ ਅਕਸਰ ਕਈ ਉਪਨਾਮ ਹੁੰਦੇ ਹਨ, ਪਰ CAS ਨੰਬਰ ਵਿਲੱਖਣ ਹੁੰਦਾ ਹੈ।ਦਵਾਈ ਆਰਡਰ ਕਰਦੇ ਸਮੇਂ, ਤੁਸੀਂ ਪਹਿਲਾਂ ਇਸਦਾ CAS ਨੰਬਰ ਦੇਖ ਸਕਦੇ ਹੋ।

ਘਰ ਦੇ ਨੇੜੇ, ਸਾਨੂੰ ਇਨ੍ਹਾਂ ਗੱਲਾਂ ਦਾ ਸਪਸ਼ਟ ਵਰਣਨ ਕਿਉਂ ਕਰਨਾ ਪੈਂਦਾ ਹੈ?ਅਸਲ ਵਿੱਚ, ਇਹ ਆਰਐਨਏ ਕੱਢਣ ਦੀ ਗੁਣਵੱਤਾ ਦੀ ਜਾਂਚ ਕਰਨ ਲਈ ਵੀ ਹੈ.ਯੰਤਰਾਂ ਅਤੇ ਕਿੱਟਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਆਰਐਨਏ ਕੱਢਣ ਨੂੰ ਵਧੇਰੇ ਇਕਸਾਰ ਬਣਾਵੇਗੀ।ਆਮ ਪ੍ਰਯੋਗਸ਼ਾਲਾਵਾਂ ਦਾ ਕੱਢਣ ਦਾ ਪੈਮਾਨਾ ਵੱਡਾ ਨਹੀਂ ਹੈ, ਅਤੇ ਇਹ ਕਿੱਟਾਂ ਨਾਲ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।

DNase ਜਾਂ RNase ਇਲਾਜ ਦੇ ਵੇਰਵੇ
ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਮਾਤਰਾਤਮਕ ਪੀਸੀਆਰ ਦਾ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਮੁੱਦਾ ਡੀਐਨਏ ਗੰਦਗੀ ਨੂੰ ਰੋਕਣਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਜੇਕਰ ਗੰਦਗੀ ਹੈ ਤਾਂ ਪ੍ਰਯੋਗ ਨਾ ਕਰੋ।ਇਸ ਲਈ, ਇਹ ਦਰਸਾਉਣ ਲਈ ਕਿ ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਵਿੱਚ ਡੀਐਨਏ ਨੂੰ ਪੂਰੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਅਤੇ ਪੂਰੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਹਟਾ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਹੈ, ਇਹ ਦਰਸਾਉਣ ਲਈ ਕਿ ਤੁਸੀਂ ਡੀਐਨਏ ਦੀ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਲਈ ਵਰਤੀ ਗਈ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਨੂੰ ਬਿਆਨ ਕਰਨਾ ਲਾਜ਼ਮੀ ਹੈ।ਇੱਕ ਯੋਜਨਾਬੱਧ ਚਿੱਤਰ ਦੁਆਰਾ ਦਰਸਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ।

RNA ਅਤੇ DNA ਦਾ ਯੋਜਨਾਬੱਧ ਚਿੱਤਰ
ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਡੀਐਨਏ ਨੂੰ ਹਟਾਉਣ ਦਾ ਤਰੀਕਾ ਕੱਢਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਡੀਐਨਏ ਨਾਲ ਆਰਐਨਏ ਦਾ ਇਲਾਜ ਕਰਨਾ ਹੈ।ਹਾਲਾਂਕਿ, ਇਹ ਮੁਕਾਬਲਤਨ ਪੁਰਾਣੇ ਢੰਗ ਹਨ.ਵਪਾਰਕ ਆਰਐਨਏ ਐਕਸਟਰੈਕਸ਼ਨ ਕਿੱਟਾਂ ਡੀਐਨਏਸ ਨੂੰ ਸ਼ਾਮਲ ਕੀਤੇ ਬਿਨਾਂ ਕੱਢਣ ਦੀ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਦੌਰਾਨ ਡੀਐਨਏ ਨੂੰ ਹਟਾਉਣ ਦੇ ਯੋਗ ਹੋ ਗਈਆਂ ਹਨ।ਉਦਾਹਰਨ ਲਈ, ਫੋਰਜੀਨ ਤੋਂ ਕਿੱਟਾਂ ਦੀ ਇੱਕ ਲੜੀ।

ਨੋਟ ਕਰੋ: ਆਰਐਨਏ ਕੱਢਣ ਦੇ ਦੌਰਾਨ ਡੀਐਨਏ ਨੂੰ ਹਟਾਉਣਾ ਇੱਕ ਬਹੁਤ ਹੀ ਖ਼ਤਰਨਾਕ ਦੋਧਾਰੀ ਤਲਵਾਰ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ ਆਰਐਨਏ ਕੱਢਣ ਦੇ ਕੰਮ ਦੇ ਸਮੇਂ ਨੂੰ ਲੰਮਾ ਕਰੇਗੀ ਅਤੇ ਆਰਐਨਏ ਡਿਗਰੇਡੇਸ਼ਨ ਦੇ ਜੋਖਮ ਨੂੰ ਵਧਾਏਗੀ।ਅਸਲ ਵਿੱਚ, ਇਹ ਆਰਐਨਏ ਉਪਜ ਅਤੇ ਸ਼ੁੱਧਤਾ ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਇੱਕ ਵਪਾਰ-ਬੰਦ ਹੈ।

ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਸਿਲਿਕਾ-ਅਧਾਰਤ ਸੋਸ਼ਣ ਕਾਲਮ ਵਿੱਚ ਜੋੜੀ ਗਈ DNase ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਬਹੁਤ ਘੱਟ ਹੈ, ਅਤੇ ਪ੍ਰਭਾਵ ਨੂੰ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਨ ਲਈ ਉੱਚ-ਗੁਣਵੱਤਾ ਵਾਲੇ DNase ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਜਾਣੀ ਚਾਹੀਦੀ ਹੈ।ਗੈਰ-ਅਨੁਕੂਲਿਤ DNase ਜਲਦੀ ਅਤੇ ਪੂਰੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਹਜ਼ਮ ਨਹੀਂ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਇਹ ਵਪਾਰੀ ਦੇ ਤਕਨੀਕੀ ਪੱਧਰ ਦੀ ਜਾਂਚ ਹੈ।ਬੇਸ਼ੱਕ, ਇੱਥੇ ਹੋਰ ਵੀ ਅਜੀਬ ਵਪਾਰੀ ਹਨ ਜੋ ਸ਼ੇਖੀ ਮਾਰਦੇ ਹਨ ਕਿ ਡੀਐਨਏ ਨੂੰ ਡੀਐਨਏ ਤੋਂ ਬਿਨਾਂ ਹਟਾਇਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ.ਇਹ ਕਿਹਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ ਕਿ ਕੋਈ ਵੀ ਜੋ ਸ਼ੇਖ਼ੀ ਮਾਰਦਾ ਹੈ ਕਿ ਡੀਐਨਏ ਨੂੰ ਡੀਐਨਏ ਤੋਂ ਬਿਨਾਂ ਪੂਰੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਹਟਾਇਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਉਹ ਗੁੰਡਾ ਹੈ।ਡੀਐਨਏ ਇੱਕ ਮੁਕਾਬਲਤਨ ਸਥਿਰ ਡਬਲ-ਸਟੈਂਡਡ ਢਾਂਚਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਇਸਨੂੰ ਸਿਰਫ਼ ਬੋਲਣ ਅਤੇ ਹੱਸਣ ਨਾਲ ਮਿਟਾਇਆ ਨਹੀਂ ਜਾ ਸਕਦਾ।

ਗੰਦਗੀ ਦਾ ਮੁਲਾਂਕਣ
ਮੁਲਾਂਕਣ ਵਿਧੀ: ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਫੋਰਸਿਸ ਖੋਜ, 1% ਐਗਰੋਸ, 6V/ਸੈ.ਮੀ., 15 ਮਿੰਟ, ਲੋਡਿੰਗ 1-3 ul

ਨਿਊਕਲੀਕ ਐਸਿਡ ਮਾਤਰਾਤਮਕ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ
ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਯੂਵੀ ਸਪੈਕਟਰੋਫੋਟੋਮੀਟਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਮਾਪਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਮੈਨੂੰ ਪਹਿਲਾਂ OD260, OD280, ਅਤੇ OD230 ਦੇ ਤਿੰਨ ਮੁੱਲਾਂ ਦੇ ਅਰਥਾਂ ਨੂੰ ਪ੍ਰਸਿੱਧ ਬਣਾਉਣ ਦਿਓ।
·OD260nm: ਇਹ ਨਿਊਕਲੀਕ ਐਸਿਡ ਦੀ ਸਭ ਤੋਂ ਉੱਚੀ ਸਮਾਈ ਪੀਕ ਦੀ ਸਮਾਈ ਤਰੰਗ ਲੰਬਾਈ ਹੈ, ਅਤੇ ਸਭ ਤੋਂ ਵਧੀਆ ਮਾਪਿਆ ਮੁੱਲ 0.1 ਤੋਂ 1.0 ਤੱਕ ਹੁੰਦਾ ਹੈ।ਜੇਕਰ ਨਹੀਂ, ਤਾਂ ਇਸ ਨੂੰ ਸੀਮਾ ਦੇ ਅੰਦਰ ਲਿਆਉਣ ਲਈ ਨਮੂਨੇ ਨੂੰ ਪਤਲਾ ਜਾਂ ਕੇਂਦਰਿਤ ਕਰੋ।
·OD280nm: ਇਹ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਅਤੇ ਫੀਨੋਲਿਕ ਪਦਾਰਥਾਂ ਦੀ ਸਭ ਤੋਂ ਉੱਚੀ ਸਮਾਈ ਪੀਕ ਦੀ ਸਮਾਈ ਤਰੰਗ ਲੰਬਾਈ ਹੈ।
·OD230nm: ਇਹ ਕਾਰਬੋਹਾਈਡਰੇਟ ਦੀ ਸਭ ਤੋਂ ਉੱਚੀ ਸਮਾਈ ਪੀਕ ਦੀ ਸਮਾਈ ਤਰੰਗ ਲੰਬਾਈ ਹੈ।

ਅੱਗੇ, ਆਓ ਹਰੇਕ ਸੂਚਕ ਦੀ ਭੂਮਿਕਾ ਬਾਰੇ ਗੱਲ ਕਰੀਏ।A260 ਲਈ, ਇਸਦੀ ਵਰਤੋਂ ਨਿਊਕਲੀਕ ਐਸਿਡ ਦੀ ਪੈਦਾਵਾਰ ਨੂੰ ਮਾਪਣ ਲਈ ਕੀਤੀ ਜਾ ਸਕਦੀ ਹੈ।ਜਦੋਂ OD260=1, dsDNA=50μg/ml, ssDNA=37μg/ml, RNA=40μg/ml।

ਸ਼ੁੱਧਤਾ ਲਈ, ਸਾਨੂੰ ਉਹਨਾਂ ਅਨੁਪਾਤਾਂ ਨੂੰ ਦੇਖਣ ਦੀ ਲੋੜ ਹੈ ਜੋ ਅਸੀਂ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਦੇਖਦੇ ਹਾਂ: OD260/280 ਅਤੇ OD260/230।
ਸ਼ੁੱਧ ਡੀਐਨਏ: OD260/280 ਲਗਭਗ 1.8 ਦੇ ਬਰਾਬਰ ਹੈ।ਜਦੋਂ ਇਹ 1.9 ਤੋਂ ਵੱਧ ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਤਾਂ ਇਹ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ RNA ਪ੍ਰਦੂਸ਼ਣ ਹੈ, ਅਤੇ ਜਦੋਂ ਇਹ 1.6 ਤੋਂ ਘੱਟ ਹੈ, ਤਾਂ ਇਹ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਅਤੇ ਫਿਨੋਲ ਪ੍ਰਦੂਸ਼ਣ ਹੈ।
· ਸ਼ੁੱਧ RNA: 1.7
·OD260/230: ਭਾਵੇਂ ਇਹ DNA ਹੋਵੇ ਜਾਂ RNA, ਹਵਾਲਾ ਮੁੱਲ 2.5 ਹੈ।ਜਦੋਂ ਇਹ 2.0 ਤੋਂ ਘੱਟ ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਤਾਂ ਇਹ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਖੰਡ, ਨਮਕ ਅਤੇ ਜੈਵਿਕ ਪਦਾਰਥ ਦਾ ਪ੍ਰਦੂਸ਼ਣ ਹੈ।

RNA ਇਕਸਾਰਤਾ

RNA ਦੀ ਇਕਸਾਰਤਾ ਨੂੰ ਮਾਪਣ ਲਈ ਇਹ ਬਹੁਤ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਹੈ.ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਇਹ ਜਾਂਚ ਕਰਨ ਲਈ ਕਿ ਕੀ 28S ਅਤੇ 18S RNA ਵਿਚਕਾਰ ਚਮਕ ਦੋ-ਗੁਣਾ ਰਿਸ਼ਤਾ ਹੈ, ਇੱਕ ਆਰਐਨਏ ਡੈਨੇਚਰੇਸ਼ਨ ਜੈੱਲ ਪ੍ਰਯੋਗ ਕਰਨਾ ਜ਼ਰੂਰੀ ਹੈ।ਜਦੋਂ ਤੀਜਾ ਬੈਂਡ 5S ਦਿਖਾਈ ਦਿੰਦਾ ਹੈ, ਤਾਂ ਇਸਦਾ ਮਤਲਬ ਹੈ ਕਿ ਆਰਐਨਏ ਘਟਣਾ ਸ਼ੁਰੂ ਹੋ ਗਿਆ ਹੈ, ਇਨਵਰਟੇਬਰੇਟਸ ਨੂੰ ਛੱਡ ਕੇ।

ਆਰਐਨਏ ਗੁਣਵੱਤਾ ਮੁਲਾਂਕਣ ਲਈ ਡੇਟਾ: ਉਪਰੋਕਤ ਟੈਸਟਾਂ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਆਰਐਨਏ ਇਕਸਾਰਤਾ ਦੇ ਸੰਦਰਭ ਵਿੱਚ ਕੁਝ ਹੋਰ ਉੱਨਤ ਸਾਧਨ ਟੈਸਟ ਵੀ ਹਨ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਐਕਸਪੀਰੀਓਨ ਆਟੋਮੈਟਿਕ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਫੋਰੇਸਿਸ ਸਿਸਟਮ ਦਾ RQI ਅਖੰਡਤਾ ਟੈਸਟ, ਜੋ ਇਹ ਪਤਾ ਲਗਾ ਸਕਦਾ ਹੈ ਕਿ ਕੀ ਆਰਐਨਏ ਅਦਿੱਖ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਘਟਿਆ ਹੈ ਜਾਂ ਨਹੀਂ।

ਵਿਗਿਆਨਕ ਖੋਜ ਵਿੱਚ, ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਮਾਤਰਾਤਮਕ ਪੀਸੀਆਰ ਟੀਚਾ ਜੀਨ ਅਤੇ ਅੰਦਰੂਨੀ ਸੰਦਰਭ ਜੀਨ ਵਿਚਕਾਰ ਤੁਲਨਾ ਹੈ।ਇਸ ਲਈ, ਆਰਐਨਏ ਨਮੂਨੇ ਦੀ ਸੰਭਾਲ, ਆਰਐਨਏ ਕੱਢਣ, ਆਦਿ ਦੀ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਵਿੱਚ, ਪ੍ਰਾਇਮਰੀ ਟੀਚਾ ਆਰਐਨਏ ਦੀ ਇਕਸਾਰਤਾ ਨੂੰ ਯਕੀਨੀ ਬਣਾਉਣਾ ਹੈ।

ਆਰਐਨਏ ਦੀ ਇਕਸਾਰਤਾ ਨਿਸ਼ਾਨਾ ਜੀਨ ਅਤੇ ਅੰਦਰੂਨੀ ਸੰਦਰਭ ਜੀਨ ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਸੰਤੁਲਨ ਨੂੰ ਕਿਵੇਂ ਪ੍ਰਭਾਵਿਤ ਕਰਦੀ ਹੈ, ਹੇਠਾਂ ਦਿੱਤੇ ਚਿੱਤਰ ਤੋਂ ਆਸਾਨੀ ਨਾਲ ਸਮਝਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਡੀਗਰੇਡੇਸ਼ਨ ਜੀਨ ਦੀ ਅਪੂਰਣਤਾ ਵੱਲ ਲੈ ਜਾਵੇਗਾ, ਭਾਵੇਂ ਇਹ ਅੰਦਰੂਨੀ ਸੰਦਰਭ ਜੀਨ ਦੀ ਅਪੂਰਤੀ ਹੋਵੇ ਜਾਂ ਟੀਚੇ ਵਾਲੇ ਜੀਨ ਦੀ ਅਧੂਰੀ ਹੋਵੇ, ਇਸਦਾ ਡੇਟਾ 'ਤੇ ਬਹੁਤ ਪ੍ਰਭਾਵ ਪਵੇਗਾ।

ਟੀਚਾ ਜੀਨ ਅਤੇ ਸੰਦਰਭ ਜੀਨ ਦਾ ਯੋਜਨਾਬੱਧ ਚਿੱਤਰ, ਸੱਚ ਨਹੀਂ ਹੋਣਾ ਚਾਹੀਦਾ

ਇਨਿਬਿਸ਼ਨ ਟੈਸਟ (ਭਾਵੇਂ ਸੀਟੀ ਮੁੱਲ ਨੂੰ ਉੱਚ ਜਾਂ ਘੱਟ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਜਾਂ ਹੋਰ ਸਥਿਤੀਆਂ ਵਿੱਚ ਦਬਾਇਆ ਗਿਆ ਹੋਵੇ)

ਇਸ ਅੰਕੜੇ ਨੂੰ ਉਦਾਹਰਨ ਵਜੋਂ ਲੈਂਦੇ ਹੋਏ, ਪੰਜ ਵਕਰਾਂ ਦੇ Ct ਮੁੱਲ ਹੇਠਾਂ ਦਿੱਤੇ ਅਨੁਸਾਰ ਹਨ।ਕਰਵ ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ CT ਮੁੱਲਾਂ ਦੀ ਵੰਡ ਅਸਮਾਨ ਹੁੰਦੀ ਹੈ, ਅਤੇ Ct ਮੁੱਲ ਉੱਚ ਅਤੇ ਘੱਟ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਦੇ ਅਧੀਨ ਦੇਰੀ ਨਾਲ ਹੁੰਦੇ ਹਨ, ਜੋ ਕਿ PCR ਰੋਕ ਦਾ ਮਾਮਲਾ ਹੈ।

ਮੁੱਖ ਨੁਕਤਾ: ਆਰਐਨਏ ਕੱਢਣ ਦੀ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਵਿੱਚ, ਸਾਨੂੰ ਗਲਤ ਧਾਰਨਾਵਾਂ ਨੂੰ ਛੱਡਣ ਅਤੇ ਸਹੀ ਧਾਰਨਾਵਾਂ ਸਥਾਪਤ ਕਰਨ ਦੀ ਲੋੜ ਹੈ।

ਗਲਤ ਵਿਚਾਰ ਇਹ ਹੈ: ਆਰਐਨਏ ਕੱਢਣਾ ਸਿਰਫ ਉਪਜ ਦਾ ਪਿੱਛਾ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਇਹ ਸੋਚਦੇ ਹੋਏ ਕਿ ਆਰਐਨਏ ਦੀ ਜਿੰਨੀ ਵੱਡੀ ਮਾਤਰਾ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ, ਉੱਨਾ ਹੀ ਵਧੀਆ ਹੁੰਦਾ ਹੈ।ਵਾਸਤਵ ਵਿੱਚ, ਜਦੋਂ ਅਸੀਂ ਗਣਨਾ ਕਰਦੇ ਹਾਂ, ਜੇ ਜੀਨਾਂ ਦੀ ਗਿਣਤੀ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਨਹੀਂ ਹੈ, ਤਾਂ ਸਾਨੂੰ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ RNA ਦੀ ਲੋੜ ਨਹੀਂ ਹੈ।ਤੁਹਾਡੇ ਦੁਆਰਾ ਕੱਢੇ ਗਏ RNA ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਕਾਫ਼ੀ ਤੋਂ ਵੱਧ ਹੈ।

ਸਹੀ ਧਾਰਨਾ ਹੈ:ਆਰਐਨਏ ਕੱਢਣ ਨੂੰ ਸ਼ੁੱਧਤਾ, ਅਖੰਡਤਾ ਅਤੇ ਇਕਸਾਰਤਾ ਦਾ ਪਿੱਛਾ ਕਰਨਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ.ਸ਼ੁੱਧਤਾ ਇਹ ਸੁਨਿਸ਼ਚਿਤ ਕਰ ਸਕਦੀ ਹੈ ਕਿ ਬਾਅਦ ਦੇ ਉਲਟ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਨੂੰ ਰੋਕਿਆ ਨਹੀਂ ਗਿਆ ਹੈ ਅਤੇ ਡੇਟਾ ਡੀਐਨਏ ਦੁਆਰਾ ਪ੍ਰਭਾਵਿਤ ਨਹੀਂ ਹੋਵੇਗਾ।ਇਕਸਾਰਤਾ ਟੀਚੇ ਦੇ ਕ੍ਰਮ ਅਤੇ ਅੰਦਰੂਨੀ ਸੰਦਰਭਾਂ ਦੇ ਸੰਤੁਲਨ ਨੂੰ ਯਕੀਨੀ ਬਣਾਉਂਦੀ ਹੈ।ਇਕਸਾਰਤਾ ਸਥਿਰ ਨਮੂਨਾ ਲੋਡਿੰਗ ਨੂੰ ਯਕੀਨੀ ਬਣਾਉਂਦੀ ਹੈ।

MIQE (4) - ਉਲਟਾ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ
ਭੁਲੇਖਾ: ਉੱਚ ਨਮੂਨਾ ਵਾਲੀਅਮ ਦਾ ਪਿੱਛਾ.
ਸਹੀ ਧਾਰਨਾ: ਇਕਸਾਰਤਾ (ਸਥਿਰਤਾ) ਦਾ ਪਿੱਛਾ ਕਰੋ, ਆਰਐਨਏ ਲੋਡ ਕੀਤੇ ਗਏ ਮਾਤਰਾ ਦੀ ਪਰਵਾਹ ਕੀਤੇ ਬਿਨਾਂ, ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਦੀ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਇਕਸਾਰ ਰਹਿੰਦੀ ਹੈ, ਇਹ ਸੁਨਿਸ਼ਚਿਤ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਕਿ cDNA ਵਿੱਚ ਅੰਤਰ ਅਸਲ ਵਿੱਚ mRNA ਵਿੱਚ ਅੰਤਰ ਨੂੰ ਦਰਸਾ ਸਕਦੇ ਹਨ।
ਅਸੀਂ ਇੱਕ ਯੋਜਨਾਬੱਧ ਚਿੱਤਰ ਨਾਲ ਇਸ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਦੀ ਵਿਆਖਿਆ ਕਰਦੇ ਹਾਂ:

ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਦਾ ਯੋਜਨਾਬੱਧ ਚਿੱਤਰ, ਸੱਚ ਨਾ ਬਣੋ
ਸਭ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ, ਸਾਨੂੰ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਅਤੇ ਪੀਸੀਆਰ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਵਿੱਚ ਅੰਤਰ ਨੂੰ ਸਮਝਣ ਦੀ ਲੋੜ ਹੈ।ਪੀਸੀਆਰ ਕਈ ਹੀਟਿੰਗ ਅਤੇ ਐਨੀਲਿੰਗ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆਵਾਂ ਵਿੱਚੋਂ ਗੁਜ਼ਰਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਨਿਸ਼ਾਨਾ ਟੁਕੜਾ ਤੇਜ਼ੀ ਨਾਲ ਵਧਦਾ ਹੈ;ਜਦੋਂ ਕਿ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਵਿੱਚ ਇਹ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਨਹੀਂ ਹੁੰਦੀ ਹੈ, ਅਸੀਂ ਕਲਪਨਾ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹਾਂ ਕਿ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਅਸਲ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਤੋਂ ਇੱਕ ਹੈ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਤੀ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਦੇ ਦੌਰਾਨ, ਆਰ.ਐਨ.ਏ. ਦੇ ਬਹੁਤ ਸਾਰੇ ਟੁਕੜੇ

ਜਿਵੇਂ ਕਿ cDNA ਜਾਣਕਾਰੀ ਦੇ ਬਹੁਤ ਸਾਰੇ ਟੁਕੜੇ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹਨ, ਇਸ ਨੂੰ ਹੁਣ ਤੱਕ ਸਮਝ ਲੈਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ, ਕਿਉਂਕਿ ਵੱਡੇ ਅਤੇ ਛੋਟੇ ਟੁਕੜਿਆਂ ਨੂੰ ਉਲਟਾ-ਲਿਪੀਕਰਨ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ, ਅਤੇ ਇੱਕ ਟੁਕੜੇ 'ਤੇ ਧਿਆਨ ਕੇਂਦਰਿਤ ਕਰਨਾ ਅਸੰਭਵ ਹੈ।ਅਤੇ ਕਿਉਂਕਿ ਆਰਐਨਏ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਮੁਕਾਬਲਤਨ ਛੋਟੀ ਹੈ, ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੀ ਸੀਡੀਐਨਏ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਵੀ ਮੁਕਾਬਲਤਨ ਛੋਟੀ ਹੈ, ਪੀਸੀਆਰ ਦੇ ਉਲਟ, ਜਿਸਦਾ ਇੱਕ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਪ੍ਰਭਾਵ ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਇਸਲਈ ਇਸਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾਉਣਾ ਅਸਲ ਵਿੱਚ ਅਸੰਭਵ ਹੈ।

cDNA ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਫੋਰੇਸਿਸ ਨਤੀਜੇ
ਦੂਜਾ, ਆਦਰਸ਼ਕ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਇਕ-ਤੋਂ-ਇਕ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਪਰ ਕਿਸੇ ਵੀ ਕੰਪਨੀ ਤੋਂ ਕੋਈ ਵੀ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟਸ ਇਸ ਪ੍ਰਭਾਵ ਨੂੰ ਪ੍ਰਾਪਤ ਨਹੀਂ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਅਸਲ ਵਿੱਚ, ਜ਼ਿਆਦਾਤਰ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟਸ ਦੀ ਕੁਸ਼ਲਤਾ 30-50% ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਘੁੰਮਦੀ ਹੈ।ਜੇਕਰ ਅਜਿਹਾ ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਤਾਂ ਸਾਡੇ ਕੋਲ ਇੱਕ ਮੁਕਾਬਲਤਨ ਸਥਿਰ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਹੋਵੇਗੀ, ਜੋ ਅਸੀਂ ਚਿੱਤਰ ਵਿੱਚ ਦੇਖਣਾ ਚਾਹੁੰਦੇ ਹਾਂ: 3 RNAs ਨੂੰ 2 cDNAs, 6 RNAs ਨੂੰ 4 cDNAs ਪ੍ਰਾਪਤ ਹੁੰਦੇ ਹਨ, ਇਸ ਲਈ ਭਾਵੇਂ ਕਿੰਨਾ ਵੀ ਨਮੂਨਾ ਲੋਡ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੋਵੇ, ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਮੁਕਾਬਲਤਨ ਸਥਿਰ ਹੈ।ਅਸੀਂ ਅਜਿਹੀ ਸਥਿਤੀ ਨੂੰ ਨਹੀਂ ਦੇਖਣਾ ਚਾਹੁੰਦੇ ਜਿੱਥੇ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਅਸਥਿਰ ਹੈ ਅਤੇ ਉੱਚ ਇਕਾਗਰਤਾ ਨੂੰ ਰੋਕਿਆ ਗਿਆ ਹੈ।

ਇਸ ਲਈ, ਇਹ ਕਿਵੇਂ ਤਸਦੀਕ ਕਰਨਾ ਹੈ ਕਿ ਕੀ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਸਥਿਰ ਹੈ?ਵਿਧੀ ਬਹੁਤ ਸਰਲ ਹੈ, ਤੁਹਾਨੂੰ ਸਿਰਫ ਇੱਕ ਤੁਲਨਾਤਮਕ ਟੈਸਟ ਕਰਨ ਦੀ ਲੋੜ ਹੈ: ਇੱਕ ਆਰਐਨਏ ਨੂੰ ਦੁੱਗਣਾ ਕਰਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਸੀਡੀਐਨਏ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਤੀਲਿਪੀ ਨੂੰ ਉਲਟਾਉਣਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਦੂਜਾ ਸੀਡੀਐਨਏ ਵਿੱਚ ਉਲਟਾ ਪ੍ਰਤੀਲਿਪੀ ਕਰਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਦੁੱਗਣਾ ਪਤਲਾ ਬਣਾਉਣਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਫਿਰ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੀ ਢਲਾਣ ਨੂੰ ਵੇਖਣ ਲਈ qPCR ਕਰਨਾ ਹੈ ਕਿ ਇਹ ਇਕਸਾਰ ਹੈ।ਇੱਕ ਚੋਟੀ ਦੇ ਵਿਦਿਆਰਥੀ ਹੋਣ ਦੇ ਨਾਤੇ, ਤੁਹਾਨੂੰ ਇਸਨੂੰ ਸਕਿੰਟਾਂ ਵਿੱਚ ਸਮਝਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ।ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਹੇਠਾਂ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ:

ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਦੀ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਸਥਿਰ ਹੈ ਜਾਂ ਨਹੀਂ ਇਹ ਜਾਂਚ ਕਰਨ ਲਈ RNA ਅਤੇ cDNA ਦਾ ਪਤਲਾ ਹੋਣਾ
ਉਲਟਾ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟਸ ਅਤੇ ਕਿੱਟ
ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਮਾਤਰਾਤਮਕ ਪੀਸੀਆਰ ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਨਦਾਰ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟੇਜ ਅਤੇ ਕਿੱਟ ਕਿਵੇਂ ਹੋ ਸਕਦੀ ਹੈ।ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟਸ ਨੂੰ ਸਰੋਤ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ ਮੋਟੇ ਤੌਰ 'ਤੇ ਦੋ ਕਿਸਮਾਂ ਵਿੱਚ ਵੰਡਿਆ ਗਿਆ ਹੈ, AMV ਜਾਂM-MLV, ਅਤੇ ਉਹਨਾਂ ਦੀ ਕਾਰਗੁਜ਼ਾਰੀ ਉਹੀ ਹੈ ਜੋ ਸਾਰਣੀ ਵਿੱਚ ਦਿਖਾਈ ਗਈ ਹੈ।

RNase H ਗਤੀਵਿਧੀ
RNase H Ribonuclease H ਹੈ, ਚੀਨੀ ਨਾਮ ਰਿਬੋਨਿਊਕਲੀਜ਼ H ਹੈ, ਜੋ ਕਿ ਇੱਕ ਐਂਡੋਰੀਬੋਨਿਊਕਲੀਜ਼ ਹੈ ਜੋ DNA-RNA ਹਾਈਬ੍ਰਿਡ ਚੇਨ ਵਿੱਚ ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ RNA ਨੂੰ ਹਾਈਡ੍ਰੋਲਾਈਜ਼ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ।RNase H ਸਿੰਗਲ-ਸਟ੍ਰੈਂਡਡ ਜਾਂ ਡਬਲ-ਸਟ੍ਰੈਂਡਡ ਡੀਐਨਏ ਜਾਂ ਆਰਐਨਏ ਵਿੱਚ ਫਾਸਫੋਡੀਸਟਰ ਬਾਂਡਾਂ ਨੂੰ ਹਾਈਡ੍ਰੋਲਾਈਜ਼ ਨਹੀਂ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਯਾਨੀ ਇਹ ਸਿੰਗਲ-ਸਟ੍ਰੈਂਡਡ ਜਾਂ ਡਬਲ-ਸਟ੍ਰੈਂਡਡ ਡੀਐਨਏ ਜਾਂ ਆਰਐਨਏ ਨੂੰ ਹਜ਼ਮ ਨਹੀਂ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ cDNA ਦੇ ਦੂਜੇ ਸਟ੍ਰੈਂਡ ਦੇ ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਵਿੱਚ ਵਰਤਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।

ਇਹ ਇੱਕ ਅਜੀਬ ਗੱਲ ਹੈ.ਅਸੀਂ ਕਹਿੰਦੇ ਹਾਂ ਕਿ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟੇਜ ਵਿੱਚ RNase H ਗਤੀਵਿਧੀ ਹੁੰਦੀ ਹੈ, ਇਹ ਨਹੀਂ ਕਿ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟੇਜ ਵਿੱਚ RNase H ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਇਹ RNase H ਨੂੰ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟੇਜ ਤੋਂ ਵੱਖ ਕਰਨਾ ਸੰਭਵ ਨਹੀਂ ਹੋ ਸਕਦਾ, ਸ਼ਾਇਦ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟੇਜ ਵਿੱਚ ਕੁਝ ਸਮੂਹਾਂ ਦੇ ਸੰਰੂਪਣ ਕਾਰਨ ਇਹ ਗਤੀਵਿਧੀ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟੇਜ ਦੇ ਕਾਰਨ ਹੁੰਦੀ ਹੈ।

ਇਸ ਲਈ, AMV ਦੀ ਉੱਚ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਦੀ ਪਰਵਾਹ ਕੀਤੇ ਬਿਨਾਂ, ਇਸਦੀ RNase H ਗਤੀਵਿਧੀ cDNA ਦੀ ਪੈਦਾਵਾਰ ਨੂੰ ਘਟਾਉਂਦੀ ਹੈ।ਬੇਸ਼ੱਕ, ਰੀਐਜੈਂਟ ਨਿਰਮਾਤਾ cDNA ਦੀ ਪੈਦਾਵਾਰ ਨੂੰ ਵਧਾਉਣ ਲਈ ਜਿੰਨਾ ਸੰਭਵ ਹੋ ਸਕੇ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟੇਜ ਵਿੱਚ RNase H ਗਤੀਵਿਧੀ ਨੂੰ ਖਤਮ ਕਰਨ ਲਈ ਆਪਣੇ ਉਤਪਾਦਾਂ ਨੂੰ ਲਗਾਤਾਰ ਅਨੁਕੂਲ ਬਣਾ ਰਹੇ ਹਨ।
ਐਨੀਲਿੰਗ ਤਾਪਮਾਨ

ਵੱਖ-ਵੱਖ ਤਾਪਮਾਨਾਂ 'ਤੇ RNA ਦੀ ਸੈਕੰਡਰੀ ਬਣਤਰ
ਵੱਖ-ਵੱਖ ਤਾਪਮਾਨਾਂ 'ਤੇ RNA ਦੀ ਸੈਕੰਡਰੀ ਬਣਤਰ ਲਈ ਉਪਰੋਕਤ ਚਿੱਤਰ ਦੇਖੋ, ਅਤੇ ਖਾਸ ਤਾਪਮਾਨ ਅਤੇ ਲੂਣ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਦੀਆਂ ਸਥਿਤੀਆਂ ਦੇ ਅਧੀਨ ਟੀਚੇ ਦੇ ਟੁਕੜੇ ਦੀ ਸੈਕੰਡਰੀ ਬਣਤਰ ਨੂੰ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨ ਲਈ mFold ਔਨਲਾਈਨ ਟੂਲ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ।55°C 'ਤੇ, RNA ਦੀ ਸੈਕੰਡਰੀ ਬਣਤਰ ਅਜੇ ਵੀ ਬਹੁਤ ਗੁੰਝਲਦਾਰ ਹੈ, ਉਲਟਾ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟੇਜ ਕੰਮ ਨਹੀਂ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਸੈਕੰਡਰੀ ਬਣਤਰ ਨੂੰ 65°C ਤੱਕ ਪੂਰੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਹੱਲ ਨਹੀਂ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਜਦੋਂ ਕਿ AMV ਅਤੇ M-MLV ਦਾ ਸਰਵੋਤਮ ਤਾਪਮਾਨ ਇਸ ਤਾਪਮਾਨ ਤੋਂ ਬਹੁਤ ਘੱਟ ਹੈ।
ਮੈਂ ਕੀ ਕਰਾਂ?ਸੈਕੰਡਰੀ ਬਣਤਰ ਟੈਮਪਲੇਟ ਦੀ ਪੂਰਕ ਜੋੜੀ ਹੈ, ਜਿਸ ਨਾਲ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਅਤੇ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟਸ ਅਤੇ ਟੈਂਪਲੇਟ ਵਿਚਕਾਰ ਮਜ਼ਬੂਤ ​​ਮੁਕਾਬਲਾ ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਸਮੱਸਿਆਵਾਂ ਦੀ ਇੱਕ ਲੜੀ ਹੁੰਦੀ ਹੈ ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਘੱਟ E ਅਤੇ ਮਾੜੀ ਦੁਹਰਾਉਣਯੋਗਤਾ।

ਮੈਂ ਕੀ ਕਰਾਂ?ਐਨੀਲਿੰਗ ਤਾਪਮਾਨ ਨੂੰ ਜਿੰਨਾ ਸੰਭਵ ਹੋ ਸਕੇ ਵਧਾਓ।

ਬਹੁਤ ਸਾਰੇ ਰੀਐਜੈਂਟ ਨਿਰਮਾਤਾ ਜੈਨੇਟਿਕ ਇੰਜਨੀਅਰਿੰਗ ਦੁਆਰਾ ਆਪਣੇ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਟਸ ਨੂੰ ਸੁਧਾਰ ਰਹੇ ਹਨ।ਕੁਝ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ ਨੂੰ ਵਧਾਉਂਦੇ ਹਨ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਜੀਫਾਨ ਅਤੇ ਆਈਡੇਲਾਈ, ਅਤੇ ਕੁਝ ਐਨਜ਼ਾਈਮ ਅਤੇ ਆਰਐਨਏ ਟੈਂਪਲੇਟ ਵਿਚਕਾਰ ਸਬੰਧ ਨੂੰ ਬਿਹਤਰ ਬਣਾਉਣ ਲਈ RNase H ਐਨਜ਼ਾਈਮ ਦੇ ਸਰਗਰਮ ਸਮੂਹ ਨੂੰ ਹਟਾ ਦਿੰਦੇ ਹਨ।ਉੱਚ ਸਾਂਝ ਮੁਕਾਬਲੇਬਾਜ਼ੀ ਨਾਲ ਸੈਕੰਡਰੀ ਢਾਂਚੇ ਨੂੰ ਬਾਹਰ ਕੱਢ ਸਕਦੀ ਹੈ ਅਤੇ ਸੁਚਾਰੂ ਢੰਗ ਨਾਲ ਪੜ੍ਹ ਸਕਦੀ ਹੈ, ਅਤੇ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਦੀ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਵਿੱਚ ਵੀ ਬਹੁਤ ਸੁਧਾਰ ਕਰ ਸਕਦੀ ਹੈ।
ਮੁੱਖ ਬਿੰਦੂ: ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਦੀ ਇਕਸਾਰਤਾ ਨੂੰ ਅੱਗੇ ਵਧਾਉਣ ਲਈ ਵਧੇਰੇ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਹੈ (ਐਨਜ਼ਾਈਮ ਨਾ ਸਿਰਫ਼ ਕੁਸ਼ਲ ਹੋਣੇ ਚਾਹੀਦੇ ਹਨ, ਸਗੋਂ ਸਥਿਰ ਵੀ ਹੋਣੇ ਚਾਹੀਦੇ ਹਨ), ਨਾ ਕਿ ਲੋਡ ਕੀਤੇ ਨਮੂਨੇ ਦੀ ਮਾਤਰਾ, ਜੇਕਰ ਇਹ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਤੌਰ 'ਤੇ ਵੱਡੇ ਪੱਧਰ ਦੇ ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਮਾਤਰਾਤਮਕ ਪੀਸੀਆਰ ਨਹੀਂ ਹੈ, ਤਾਂ ਇਹ ਬਿਲਕੁਲ ਸੰਭਵ ਨਹੀਂ ਹੋਵੇਗਾ।ਕਈ cDNAs।
ਵੱਖ-ਵੱਖ ਨਿਰਮਾਤਾਵਾਂ ਨੇ ਇਕਸਾਰਤਾ ਦੀ ਭਾਲ ਵਿਚ ਕੁਝ ਯਤਨ ਵੀ ਕੀਤੇ ਹਨ।ਉਦਾਹਰਨ ਲਈ, ਜ਼ਿਆਦਾਤਰ ਕੰਪਨੀਆਂ ਨੇ ਹੁਣ ਵਿਕਰੀ ਲਈ ਇੱਕ ਮਿਆਰੀ ਕਿੱਟ ਵਜੋਂ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਨੂੰ ਪੈਕ ਕੀਤਾ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ ਇੱਕ ਵਧੀਆ ਵਿਕਲਪ ਹੈ।
ਉਦਾਹਰਨ ਲਈ, ਫੋਰਜੀਨ ਦੀਆਂ ਆਰਟੀ ਈਜ਼ੀ ਸੀਰੀਜ਼ ਕਿੱਟਾਂ:

RT Easy I (ਪਹਿਲੀ ਸਟ੍ਰੈਂਡ cDNA ਸਿੰਥੇਸਿਸ ਕਿੱਟ ਲਈ ਮਾਸਟਰ ਪ੍ਰੀਮਿਕਸ)

MIQE (5) - ਟੀਚਾ ਜੀਨ ਜਾਣਕਾਰੀ

ਉਪਰੋਕਤ ਚਿੱਤਰ ਦੱਸਦਾ ਹੈ
1. ਕੀ ਇਹ ਜੀਨ ਵਾਰ-ਵਾਰ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਲਈ ਪ੍ਰਭਾਵੀ ਹੈ, ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਵਾਰ-ਵਾਰ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਦੁਆਰਾ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕੀਤੀ ਜਾ ਸਕਦੀ ਹੈ।
2. ਜੀਨ ਆਈਡੀ, ਤੁਸੀਂ ਜਾਣਦੇ ਹੋ।
3. ਜੀਨ ਦੀ ਲੰਬਾਈ, ਟੀਚਾ ਜੀਨ ਦੀ ਕੁੱਲ ਲੰਬਾਈ ਯਕੀਨੀ ਤੌਰ 'ਤੇ ਕੋਈ ਸਮੱਸਿਆ ਨਹੀਂ ਹੈ।ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਕਰਦੇ ਸਮੇਂ, ਇਹ ਸੁਨਿਸ਼ਚਿਤ ਕਰੋ ਕਿ ਬਿਹਤਰ ਐਂਪਲੀਕੇਸ਼ਨ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਨੂੰ ਯਕੀਨੀ ਬਣਾਉਣ ਲਈ ਐਂਪਲੀਕਨ ਦੀ ਲੰਬਾਈ 80-200bp ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਹੈ।
4. ਸੀਕੁਏਂਸ ਬਲਾਸਟ ਤੁਲਨਾ ਜਾਣਕਾਰੀ, ਗੈਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਪ੍ਰਸਾਰ ਨੂੰ ਰੋਕਣ ਲਈ ਟੀਚੇ ਦੇ ਜੀਨ ਦੀ ਤੁਲਨਾ ਜੀਨਬੈਂਕ ਵਿੱਚ ਕਰਨ ਦੀ ਲੋੜ ਹੈ।
5. ਸੂਡੋਜੀਨਸ ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ.ਇੱਕ ਸੂਡੋਜੀਨ ਇੱਕ ਆਮ ਜੀਨ ਵਰਗਾ ਇੱਕ ਡੀਐਨਏ ਕ੍ਰਮ ਹੁੰਦਾ ਹੈ ਪਰ ਆਪਣਾ ਆਮ ਕਾਰਜ ਗੁਆ ਦਿੰਦਾ ਹੈ।ਇਹ ਅਕਸਰ ਯੂਕੇਰੀਓਟਸ ਦੇ ਬਹੁ-ਜੀਨ ਪਰਿਵਾਰ ਵਿੱਚ ਮੌਜੂਦ ਹੁੰਦਾ ਹੈ।ਇਸਨੂੰ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ψ ਦੁਆਰਾ ਦਰਸਾਇਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਇਹ ਜੀਨੋਮ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਗੈਰ-ਕਾਰਜਸ਼ੀਲ ਜੀਨੋਮਿਕ ਡੀਐਨਏ ਕਾਪੀ ਹੈ ਜੋ ਕੋਡਿੰਗ ਜੀਨ ਕ੍ਰਮ ਦੇ ਬਹੁਤ ਸਮਾਨ ਹੈ।, ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਪ੍ਰਤੀਲਿਪੀ ਨਹੀਂ ਕੀਤੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ, ਅਤੇ ਇਸਦਾ ਕੋਈ ਸਪਸ਼ਟ ਸਰੀਰਕ ਅਰਥ ਨਹੀਂ ਹੁੰਦਾ ਹੈ।
6. ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਦੀ ਸਥਿਤੀ ਐਕਸੌਨ ਅਤੇ ਇਨਟ੍ਰੋਨ ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ।ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਸਾਲਾਂ ਵਿੱਚ, ਜਦੋਂ ਅਸੀਂ ਡੀਐਨਏ ਗੰਦਗੀ ਦੀ ਸਮੱਸਿਆ ਨੂੰ ਹੱਲ ਕੀਤਾ ਸੀ, ਅਸੀਂ ਅਕਸਰ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ, ਐਕਸੌਨ, ਅਤੇ ਇਨਟ੍ਰੌਨ ਦੀਆਂ ਸਥਿਤੀਆਂ ਵੱਲ ਧਿਆਨ ਦਿੱਤਾ, ਅਤੇ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਡੀਐਨਏ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਤੋਂ ਬਚਣ ਲਈ ਇੰਟਰੋਨਾਂ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਨੂੰ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਕਰਨ ਬਾਰੇ ਵਿਚਾਰ ਕੀਤਾ।ਕਿਰਪਾ ਕਰਕੇ ਹੇਠਾਂ ਦਿੱਤੀ ਤਸਵੀਰ ਦੇਖੋ: ਕਾਲਾ ਇਨਟ੍ਰੋਨ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ, ਵੱਖ-ਵੱਖ ਬਲੂਜ਼ ਐਕਸੌਨ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ, ਗੁਲਾਬੀ ਆਮ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਚਮਕਦਾਰ ਲਾਲ ਇੰਟਰਨ-ਸਪੈਨਿੰਗ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ।

ਯੋਜਨਾਬੱਧ, ਕਦੇ ਵੀ ਸੱਚ ਨਹੀਂ
ਇਹ ਕਿੰਨੀ ਸੰਪੂਰਣ ਯੋਜਨਾ ਜਾਪਦੀ ਹੈ, ਪਰ ਅਸਲ ਵਿੱਚ, ਜ਼ਿਆਦਾਤਰ ਮਾਮਲਿਆਂ ਵਿੱਚ, ਟਰਾਂਸ-ਇੰਟਰਨ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਕਲਪਨਾ ਦੇ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਜਾਦੂਈ ਨਹੀਂ ਹੁੰਦੇ, ਅਤੇ ਉਹ ਗੈਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਪ੍ਰਸਾਰਣ ਦਾ ਕਾਰਨ ਵੀ ਬਣਦੇ ਹਨ।ਇਸ ਲਈ ਡੀਐਨਏ ਦੀ ਗੰਦਗੀ ਨੂੰ ਰੋਕਣ ਦਾ ਸਭ ਤੋਂ ਵਧੀਆ ਤਰੀਕਾ ਡੀਐਨਏ ਨੂੰ ਪੂਰੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਹਟਾਉਣਾ ਹੈ।
7. ਸੰਰੂਪਣ ਦੀ ਭਵਿੱਖਬਾਣੀ।ਇਸ ਉਦਾਹਰਨ ਦੀ ਦੁਬਾਰਾ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ, ਇੱਕ ਖਾਸ ਤਾਪਮਾਨ ਅਤੇ ਲੂਣ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ 'ਤੇ ਨਿਸ਼ਾਨਾ ਟੁਕੜੇ ਦੀ ਸੈਕੰਡਰੀ ਬਣਤਰ ਨੂੰ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨ ਲਈ mFold ਔਨਲਾਈਨ ਟੂਲ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ।

ਵੱਖ-ਵੱਖ ਤਾਪਮਾਨਾਂ 'ਤੇ RNA ਦੀ ਸੈਕੰਡਰੀ ਬਣਤਰ
ਸੈਕੰਡਰੀ ਬਣਤਰ ਟੈਮਪਲੇਟ ਦੀ ਪੂਰਕ ਜੋੜੀ ਹੈ, ਜਿਸ ਨਾਲ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਅਤੇ ਟੈਂਪਲੇਟ ਜੋੜੀ ਵਿਚਕਾਰ ਮਜ਼ਬੂਤ ​​ਮੁਕਾਬਲਾ ਹੋਵੇਗਾ, ਅਤੇ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਬਾਈਡਿੰਗ ਦੀ ਸੰਭਾਵਨਾ ਘੱਟ ਹੈ, ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਸਮੱਸਿਆਵਾਂ ਦੀ ਇੱਕ ਲੜੀ ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਘੱਟ E ਅਤੇ ਮਾੜੀ ਦੁਹਰਾਉਣਯੋਗਤਾ।ਸੌਫਟਵੇਅਰ ਪੂਰਵ-ਅਨੁਮਾਨ ਦੁਆਰਾ, ਜੇਕਰ ਕੋਈ ਸੈਕੰਡਰੀ ਢਾਂਚੇ ਦੀ ਸਮੱਸਿਆ ਨਹੀਂ ਹੈ, ਤਾਂ ਇਹ ਬਹੁਤ ਵਧੀਆ ਹੋਵੇਗਾ।ਜੇ ਉੱਥੇ ਹੈ, ਤਾਂ ਸਾਡਾ ਫਾਲੋ-ਅੱਪ ਲੇਖ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਤੌਰ 'ਤੇ ਇਸ ਸਮੱਸਿਆ ਨੂੰ ਹੱਲ ਕਰਨ ਦੇ ਤਰੀਕੇ ਬਾਰੇ ਚਰਚਾ ਕਰੇਗਾ।

MIQE (6)-qPCR ਓਲੀਗੋਨਿਊਕਲੀਓਟਾਈਡਸ

ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਮਾਤਰਾਤਮਕ PCR ਲਈ, ਪਹਿਲੀ ਚੀਜ਼ ਜਿਸ ਨਾਲ ਤੁਸੀਂ ਹਰ ਰੋਜ਼ ਸੰਘਰਸ਼ ਕਰਦੇ ਹੋ ਉਹ ਹੈ RNA ਕੱਢਣਾ, ਅਤੇ ਦੂਜੀ ਚੀਜ਼ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਹੋ ਸਕਦੀ ਹੈ।
ਸਭ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ, ਅਸੀਂ ਅਜੇ ਵੀ MIQE ਚੈੱਕਲਿਸਟ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਬਾਰੇ ਨਿਯਮਾਂ ਦੀ ਜਾਂਚ ਕਰਦੇ ਹਾਂ।ਇਹ ਇੰਨਾ ਸਧਾਰਨ ਹੈ ਕਿ ਕੂੜਬਾਜ਼ ਹੱਸ ਸਕਦੇ ਹਨ, ਅਤੇ ਅਸੀਂ ਇਸਨੂੰ ਇੱਕ ਵਾਕ ਵਿੱਚ ਪੂਰਾ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹਾਂ: ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਪੜਤਾਲ ਅਤੇ ਸੋਧ ਵਿਧੀ ਦੀ ਤਰਤੀਬ ਅਤੇ ਸਥਿਤੀ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾਓ।ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਸ਼ੁੱਧੀਕਰਣ ਵਿਧੀ ਲਈ, ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਇਸ ਸਮੇਂ ਬਹੁਤ ਸਸਤਾ ਹੈ, qPCR PAGE ਅਤੇ ਉਪਰੋਕਤ ਸ਼ੁੱਧੀਕਰਨ ਵਿਧੀਆਂ ਦੇ ਯੋਗ ਹੈ, ਅਤੇ ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਸਾਧਨ ਦੀ ਜਾਣਕਾਰੀ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਨਹੀਂ ਹੈ।ਬਹੁਤ ਸਾਰੇ ਲੋਕ ਦਹਾਕਿਆਂ ਤੋਂ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਕਰ ਰਹੇ ਹਨ ਅਤੇ ਇਹ ਨਹੀਂ ਜਾਣਦੇ ਕਿ ਸਿੰਥੇਸਾਈਜ਼ਰ ABI3900 ਹੈ।
ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਦੇ ਸਿਧਾਂਤਾਂ ਦੇ ਸੰਬੰਧ ਵਿੱਚ, ਤੁਹਾਨੂੰ ਉਹਨਾਂ ਨੂੰ ਰੋਟ ਦੁਆਰਾ ਯਾਦ ਕਰਨ ਦੀ ਜ਼ਰੂਰਤ ਨਹੀਂ ਹੈ, ਕਿਉਂਕਿ ਜ਼ਿਆਦਾਤਰ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਸੌਫਟਵੇਅਰ ਜਾਂ ਔਨਲਾਈਨ ਟੂਲ ਇਹਨਾਂ ਸਮੱਸਿਆਵਾਂ ਦਾ ਧਿਆਨ ਰੱਖ ਸਕਦੇ ਹਨ (ਸਿਫ਼ਾਰਸ਼ੀ ਔਨਲਾਈਨ ਟੂਲ primer3.ut.ee/), ਅਤੇ 99.999% ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਹੱਥੀਂ ਨਹੀਂ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਲੇਖਕ ਕਈ ਵਾਰ ਇੱਕ ਦਿਨ ਵਿੱਚ ਸੈਂਕੜੇ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਜੇਕਰ ਤੁਸੀਂ ਇੱਕ-ਇੱਕ ਕਰਕੇ ਪੜ੍ਹਦੇ ਹੋ, ਤਾਂ ਇਹ ਬਣ ਜਾਣਗੇ।
ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਕੀਤੇ ਜਾਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਹੇਠਾਂ ਦਿੱਤੇ ਬਿੰਦੂਆਂ ਦੀ ਜਾਂਚ ਕਰੋ:
1. 3′ ਸਿਰੇ ਦੇ ਨੇੜੇ ਡਿਜ਼ਾਇਨ ਪ੍ਰਾਈਮਰ: cDNA ਫਸਟ-ਸਟ੍ਰੈਂਡ ਸਿੰਥੇਸਿਸ ਲਈ ਓਲੀਗੋ ਡੀਟੀ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਨ ਦੇ ਮਾਮਲੇ ਵਿੱਚ, ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਅਤੇ RNA ਅਖੰਡਤਾ ਨੂੰ ਧਿਆਨ ਵਿੱਚ ਰੱਖਦੇ ਹੋਏ, ਡਿਜ਼ਾਇਨ ਕੀਤੇ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਨੂੰ ਐਂਪਲੀਫੀਕੇਸ਼ਨ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਵਿੱਚ ਸੁਧਾਰ ਕਰਨ ਲਈ 3′ ਸਿਰੇ ਦੇ ਨੇੜੇ ਡਿਜ਼ਾਇਨ ਕਰਨ ਦੀ ਲੋੜ ਹੈ।ਹੇਠਾਂ ਦਿੱਤੇ ਅਨੁਸਾਰ ਵਿਆਖਿਆ ਕਰਨ ਲਈ ਇੱਕ ਤਸਵੀਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ (ਇਸ ਨੂੰ ਸਮਝਣ ਦਾ ਕੋਈ ਤਰੀਕਾ ਨਹੀਂ ਹੈ):

ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਨੂੰ 3′ ਸਿਰੇ ਦੇ ਨੇੜੇ ਕਿਉਂ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਕੀਤਾ ਜਾਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ, ਇਹ ਸੱਚ ਨਹੀਂ ਹੋਣਾ ਚਾਹੀਦਾ
2. TM ਮੁੱਲ: Tm ਮੁੱਲ 55-65°C 'ਤੇ ਹੈ (ਕਿਉਂਕਿ exonuclease ਸਰਗਰਮੀ 60°C 'ਤੇ ਸਭ ਤੋਂ ਵੱਧ ਹੈ), ਅਤੇ GC ਸਮੱਗਰੀ 40%-60% ਹੈ।
3. ਬਲਾਸਟ: ਜੀਨੋਮ ਦੇ ਗੈਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਪ੍ਰਸਾਰਣ ਤੋਂ ਬਚਣ ਲਈ, ਪੂਰਕ ਤਸਦੀਕ ਲਈ ਬਲਾਸਟ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਜਾਣੀ ਚਾਹੀਦੀ ਹੈ।

MIQE(7)-qPCR ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ

1. qPCR ਕਿੱਟ
MIQE ਦੀਆਂ ਜ਼ਰੂਰਤਾਂ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ, ਸਾਨੂੰ ਲੇਖ ਵਿੱਚ ਪੂਰੀ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਸਥਿਤੀਆਂ ਦਾ ਸਪਸ਼ਟ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਵਰਣਨ ਕਰਨਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਪੀਸੀਆਰ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਪ੍ਰਣਾਲੀ ਦੀ ਸੰਰਚਨਾ, ਕਿਹੜੀ ਕਿੱਟ ਵਰਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ, ਨਿਰਮਾਤਾ ਕੌਣ ਹੈ, ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਪ੍ਰਣਾਲੀ ਕਿੰਨੀ ਵੱਡੀ ਹੈ, ਕੀ ਡਾਈ ਵਿਧੀ ਜਾਂ ਜਾਂਚ ਵਿਧੀ ਵਰਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ, ਪੀਸੀਆਰ ਪ੍ਰੋਗਰਾਮ ਸੈਟਿੰਗਾਂ।ਵੈਟਰਨ ਡਰਾਈਵਰਾਂ ਨੂੰ ਯਕੀਨੀ ਤੌਰ 'ਤੇ ਪਤਾ ਲੱਗੇਗਾ ਕਿ ਜਿੰਨਾ ਚਿਰ ਕਿੱਟ ਦੀ ਚੋਣ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ, ਉਪਰੋਕਤ ਜਾਣਕਾਰੀ ਮੂਲ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ.
ਵਰਤਮਾਨ ਵਿੱਚ, ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਮਾਤਰਾਤਮਕ ਪੀਸੀਆਰ ਕਿੱਟਾਂ ਦਾ ਨਿਰਮਾਣ ਅਤੇ ਉਤਪਾਦਨ ਇੱਕ ਬਹੁਤ ਹੀ ਪਰਿਪੱਕ ਤਕਨਾਲੋਜੀ ਹੈ।ਜਿੰਨਾ ਚਿਰ ਤੁਸੀਂ ਬਹੁਤ ਮਾੜੇ ਨਿਰਮਾਤਾਵਾਂ ਦੀ ਚੋਣ ਨਹੀਂ ਕਰਦੇ, ਸਮੱਸਿਆਵਾਂ ਦੀ ਸੰਭਾਵਨਾ ਜ਼ਿਆਦਾ ਨਹੀਂ ਹੈ, ਪਰ ਅਸੀਂ ਫਿਰ ਵੀ ਤੁਹਾਡੇ ਨਾਲ ਕੁਝ ਨੁਕਤੇ ਸਾਂਝੇ ਕਰਨਾ ਚਾਹੁੰਦੇ ਹਾਂ:
ਹੌਟ-ਸਟਾਰਟ ਟਾਕ ਐਨਜ਼ਾਈਮ:ਪੀਸੀਆਰ ਦਾ ਸਭ ਤੋਂ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਹਿੱਸਾ ਹਾਟ-ਸਟਾਰਟ ਟਾਕ ਐਂਜ਼ਾਈਮ ਹੈ।ਮਾਰਕੀਟ ਵਿੱਚ ਹਾਟ-ਸਟਾਰਟ ਐਂਜ਼ਾਈਮ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਦੋ ਕਿਸਮਾਂ ਵਿੱਚ ਵੰਡੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ, ਇੱਕ ਰਸਾਇਣਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਸੋਧਿਆ ਗਿਆ ਹੌਟ-ਸਟਾਰਟ ਐਂਜ਼ਾਈਮ ਹੈ (ਤੁਸੀਂ ਇਸਨੂੰ ਪੈਰਾਫਿਨ ਏਮਬੈਡਿੰਗ ਵਜੋਂ ਕਲਪਨਾ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹੋ), ਅਤੇ ਦੂਜਾ ਐਂਟੀਬਾਡੀ ਸੋਧ (ਐਂਟੀਜਨ-ਐਂਟੀਬਾਡੀ ਬਾਈਡਿੰਗ) ਲਈ ਇੱਕ ਹੌਟ-ਸਟਾਰਟ ਐਂਜ਼ਾਈਮ ਹੈ।ਰਸਾਇਣਕ ਸੋਧ ਗਰਮ-ਸ਼ੁਰੂ ਕਰਨ ਵਾਲੇ ਪਾਚਕ ਦਾ ਇੱਕ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਤਰੀਕਾ ਹੈ।ਜਦੋਂ ਇੱਕ ਨਿਸ਼ਚਿਤ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ ਪਹੁੰਚ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਤਾਂ ਐਂਜ਼ਾਈਮ ਆਪਣੀ ਗਤੀਵਿਧੀ ਨੂੰ ਛੱਡ ਦੇਵੇਗਾ।ਐਂਟੀਬਾਡੀ-ਸੋਧਿਆ ਹੋਇਆ ਹੌਟ-ਸਟਾਰਟ ਐਂਜ਼ਾਈਮ ਐਂਜ਼ਾਈਮ ਦੀ ਗਤੀਵਿਧੀ ਨੂੰ ਰੋਕਣ ਲਈ ਜੈਵਿਕ ਤਰੀਕਿਆਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦਾ ਹੈ।ਜਦੋਂ ਇੱਕ ਨਿਸ਼ਚਿਤ ਤਾਪਮਾਨ 'ਤੇ ਪਹੁੰਚ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਤਾਂ ਐਂਟੀਬਾਡੀ ਨੂੰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੇ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਨਿਸ਼ਚਿਤ ਅਤੇ ਅਕਿਰਿਆਸ਼ੀਲ ਕਰ ਦਿੱਤਾ ਜਾਵੇਗਾ, ਅਤੇ ਐਂਜ਼ਾਈਮ ਦੀ ਗਤੀਵਿਧੀ ਨੂੰ ਅਮਲ ਵਿੱਚ ਲਿਆਂਦਾ ਜਾਵੇਗਾ।

ਪਰ, ਇਸ ਦਾ ਕੀ ਫਾਇਦਾ ਹੈ?ਇਹ ਮਾਮਲਾ ਹੈ, ਐਂਟੀਬਾਡੀ-ਸੰਸ਼ੋਧਿਤ ਐਨਜ਼ਾਈਮਾਂ ਦੀ ਰਿਹਾਈ ਦੀ ਗਤੀਵਿਧੀ ਰਸਾਇਣਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਸੋਧੇ ਹੋਏ ਐਨਜ਼ਾਈਮਾਂ ਨਾਲੋਂ ਤੇਜ਼ ਹੁੰਦੀ ਹੈ, ਇਸਲਈ ਸੰਵੇਦਨਸ਼ੀਲਤਾ ਦੇ ਮਾਮਲੇ ਵਿੱਚ, ਐਂਟੀਬਾਡੀ-ਸੰਸ਼ੋਧਿਤ ਐਨਜ਼ਾਈਮਜ਼ ਦਾ ਥੋੜ੍ਹਾ ਜਿਹਾ ਫਾਇਦਾ ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਤਾਂ ਜੋ ਮਾਰਕੀਟ ਵਿੱਚ ਕਿੱਟਾਂ ਵਿੱਚ ਅਸਲ ਵਿੱਚ ਕੋਈ ਰਸਾਇਣਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਸੋਧੇ ਐਂਜ਼ਾਈਮ ਨਹੀਂ ਹੁੰਦੇ।ਜੇ ਹੈ, ਤਾਂ ਇਹ ਨਿਰਮਾਤਾ ਦੀ ਤਕਨਾਲੋਜੀ ਅਜੇ ਵੀ ਹਜ਼ਾਰਾਂ ਸਾਲਾਂ ਦੇ ਯੁੱਗ ਵਿੱਚ ਫਸ ਗਈ ਹੈ.
ਮੈਗਨੀਸ਼ੀਅਮ ਆਇਨ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ:ਪੀਸੀਆਰ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਵਿੱਚ ਮੈਗਨੀਸ਼ੀਅਮ ਆਇਨ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਬਹੁਤ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਹੈ।ਉਚਿਤ ਮੈਗਨੀਸ਼ੀਅਮ ਆਇਨ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ Taq ਐਨਜ਼ਾਈਮ ਗਤੀਵਿਧੀ ਦੀ ਰਿਹਾਈ ਨੂੰ ਉਤਸ਼ਾਹਿਤ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਜੇ ਇਕਾਗਰਤਾ ਬਹੁਤ ਘੱਟ ਹੈ, ਤਾਂ ਐਂਜ਼ਾਈਮ ਦੀ ਗਤੀਵਿਧੀ ਕਾਫ਼ੀ ਘੱਟ ਜਾਵੇਗੀ;ਜੇਕਰ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਹੈ, ਤਾਂ ਐਨਜ਼ਾਈਮ-ਕੈਟਾਲਾਈਜ਼ਡ ਗੈਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਨੂੰ ਵਧਾਇਆ ਜਾਵੇਗਾ।ਮੈਗਨੀਸ਼ੀਅਮ ਆਇਨਾਂ ਦੀ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਦੀ ਐਨੀਲਿੰਗ, ਟੈਂਪਲੇਟ ਦੇ ਪਿਘਲਣ ਵਾਲੇ ਤਾਪਮਾਨ ਅਤੇ ਪੀਸੀਆਰ ਉਤਪਾਦਾਂ ਨੂੰ ਵੀ ਪ੍ਰਭਾਵਤ ਕਰੇਗੀ, ਜਿਸ ਨਾਲ ਵਧੇ ਹੋਏ ਟੁਕੜਿਆਂ ਦੀ ਪੈਦਾਵਾਰ ਨੂੰ ਪ੍ਰਭਾਵਿਤ ਕੀਤਾ ਜਾਵੇਗਾ।ਮੈਗਨੀਸ਼ੀਅਮ ਆਇਨਾਂ ਦੀ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਨੂੰ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ 25mM 'ਤੇ ਨਿਯੰਤਰਿਤ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਬੇਸ਼ੱਕ, ਇੱਕ ਚੰਗੀ ਕਿੱਟ ਲਈ, ਮੈਗਨੀਸ਼ੀਅਮ ਆਇਨਾਂ ਦੀ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਨੂੰ ਚੰਗੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਨਿਯੰਤਰਿਤ ਕੀਤਾ ਜਾਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ।ਕੁਝ ਵਪਾਰੀ ਰੀਐਜੈਂਟ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਮੈਗਨੀਸ਼ੀਅਮ ਆਇਨ ਚੇਲੇਟਿੰਗ ਏਜੰਟ ਜੋੜਦੇ ਹਨ, ਜੋ ਮੈਗਨੀਸ਼ੀਅਮ ਆਇਨ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਦੇ ਆਟੋਮੈਟਿਕ ਐਡਜਸਟਮੈਂਟ ਦੇ ਪ੍ਰਭਾਵ ਨੂੰ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ।
ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਡਾਈ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ:ਫਲੋਰੋਸੈੰਟ ਡਾਈ, ਜੋ ਕਿ SYBR ਗ੍ਰੀਨ ਹੈ, ਜੋ ਅਸੀਂ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਵਰਤਦੇ ਹਾਂ, ਮੁੱਖ ਤੌਰ 'ਤੇ ਡਬਲ-ਸਟ੍ਰੈਂਡਡ ਡੀਐਨਏ ਦੇ ਮਾਮੂਲੀ ਗਰੂਵ ਨਾਲ ਬੰਨ੍ਹ ਕੇ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਪੈਦਾ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਕਿਉਂਕਿ ਡਬਲ-ਸਟ੍ਰੈਂਡਡ ਡੀਐਨਏ ਨਾਲ ਡਾਈ ਦੀ ਬਾਈਡਿੰਗ ਗੈਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਹੈ, ਮਤਲਬ ਕਿ ਜਦੋਂ ਤੱਕ ਡਬਲ-ਸਟ੍ਰੈਂਡਡ ਡੀਐਨਏ ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਇਸ ਨੂੰ ਡੀਐਨਏ ਨਾਲ ਜੋੜਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਇਸ ਲਈ ਫਲੋਰਸੈਂਸ ਅਤੇ ਪ੍ਰਾਇਮਰੀ ਡੀਐਨਏ ਨਾਲ ਮਿਲਾਇਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ। ਸਿਸਟਮ ਇੱਕ ਬੈਕਗਰਾਊਂਡ ਸਿਗਨਲ ਬਣਾਉਣ ਲਈ ਇਸਦੇ ਨਾਲ ਜੋੜ ਦੇਵੇਗਾ।
PS: ਇਸਦੀਆਂ ਪ੍ਰਕਾਸ਼-ਸੰਵੇਦਨਸ਼ੀਲ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾਵਾਂ ਦੇ ਕਾਰਨ, ਮਾਰਕੀਟ ਵਿੱਚ ਉਤਪਾਦ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਭੂਰੇ ਧੁੰਦਲੇ ਸੈਂਟਰਿਫਿਊਜ ਟਿਊਬਾਂ ਵਿੱਚ ਪੈਕ ਕੀਤੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ (ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਹੇਠਾਂ ਤਸਵੀਰ ਵਿੱਚ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ)।ਹਾਲਾਂਕਿ, ਇਹ ਇੱਕ ਸਮੱਸਿਆ ਦਾ ਸਾਹਮਣਾ ਕਰੇਗਾ.ਇਹ ਦੇਖਣਾ ਮੁਸ਼ਕਲ ਹੈ ਕਿ ਨਮੂਨਾ ਲੈਣ ਵੇਲੇ ਤਰਲ ਨੂੰ ਚੂਸਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਜਾਂ ਨਹੀਂ।ਇਸ ਸਬੰਧ ਵਿੱਚ, ਕਿਂਗਕੇ ਅਸਲ ਵਿੱਚ ਸਭ ਤੋਂ ਵੱਧ ਉਪਭੋਗਤਾ-ਅਨੁਕੂਲ ਹੈ (ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਹੇਠਾਂ ਤਸਵੀਰ ਵਿੱਚ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ), ਅਤੇ ਪਾਰਦਰਸ਼ੀ ਟਿਊਬ ਨੂੰ ਇੱਕ ਅਪਾਰਦਰਸ਼ੀ ਟੀਨ ਬੈਗ ਵਿੱਚ ਪੈਕ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ।ਫਿਰ ਰੌਸ਼ਨੀ ਤੋਂ ਬਚਣ ਅਤੇ ਨਮੂਨੇ ਲੈਣ ਦੀ ਸਹੂਲਤ ਨੂੰ ਧਿਆਨ ਵਿੱਚ ਰੱਖਦੇ ਹੋਏ, ਇਸਨੂੰ ਇੱਕ ਟੀਨ ਦੇ ਬੈਗ ਵਿੱਚ ਪਾਓ।ਤੁਹਾਨੂੰ ਸਹੀ ਉਤਪਾਦ ਨੰਬਰ ਚੁਣਨਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ।TSE204 ਇੱਕ ਸੁਪਰ ਲਾਗਤ-ਪ੍ਰਭਾਵਸ਼ਾਲੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਹੈ, ਜੋ ਮੈਨੂੰ ਘਾਹ ਲਗਾਉਣਾ ਚਾਹੁੰਦਾ ਹੈ।

ਫਲੋਰੋਸੈੰਟ ਡਾਈ ਦੀ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਵੀ ਬਹੁਤ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਹੈ।ਜੇਕਰ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਬਹੁਤ ਘੱਟ ਹੈ, ਤਾਂ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਕਰਵ ਬਾਅਦ ਦੇ ਪੜਾਅ ਵਿੱਚ ਉੱਪਰ ਨਹੀਂ ਜਾਵੇਗਾ ਅਤੇ ਸੰਪੂਰਨ ਨਹੀਂ ਹੈ;ਜੇਕਰ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਹੈ, ਤਾਂ ਇਹ ਸ਼ੋਰ ਦਖਲ ਦਾ ਕਾਰਨ ਬਣੇਗਾ।ਕਿਉਂਕਿ ਫਲੋਰੋਸੈੰਟ ਮਾਤਰਾਤਮਕ PCR ਮੁੱਖ ਤੌਰ 'ਤੇ CT ਮੁੱਲ 'ਤੇ ਨਿਰਭਰ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਜੇਕਰ ਫਲੋਰੋਸੈੰਟ ਡਾਈ ਦੀ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਨੂੰ ਸਹੀ ਢੰਗ ਨਾਲ ਐਡਜਸਟ ਨਹੀਂ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਤਾਂ ਨੀਵਾਂ ਬਿੰਦੂ ਉੱਚ ਬਿੰਦੂ ਨਾਲੋਂ ਬਿਹਤਰ ਹੁੰਦਾ ਹੈ।ਬੇਸ਼ੱਕ, ਢੁਕਵੀਂ ਰੰਗਤ ਇਕਾਗਰਤਾ ਸਭ ਤੋਂ ਵਧੀਆ ਹੈ.

ROX: ROX ਰੰਗਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਚੰਗੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਨਾਲ ਫਲੋਰਸੈਂਸ ਸਿਗਨਲ ਗਲਤੀਆਂ ਨੂੰ ਠੀਕ ਕਰਨ ਲਈ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ।ਕੁਝ ਯੰਤਰ ਨਿਰਮਾਤਾਵਾਂ ਨੂੰ ਕੈਲੀਬ੍ਰੇਸ਼ਨ ਦੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ, ਜਦਕਿ ਦੂਸਰੇ ਨਹੀਂ ਕਰਦੇ।ਉਦਾਹਰਨ ਲਈ, ਥਰਮੋ ਫਿਸ਼ਰ ਸਾਇੰਟਿਫਿਕ ਦੇ ਰੀਅਲ ਟਾਈਮ PCR ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਯੰਤਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਲਈ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਕੈਲੀਬ੍ਰੇਸ਼ਨ ਦੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ 7300, 7500, 7500Fast, StepOnePlus, ਆਦਿ ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ। ਆਮ ਕਿੱਟ ਨਿਰਦੇਸ਼ ਇਸਦਾ ਵਰਣਨ ਕਰਨਗੇ।
ਫੋਰਜੀਨ ਦੇ qPCR ਮਿਕਸ ਵਿੱਚ ROX ਡਾਈ ਵੀ ਸ਼ਾਮਲ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਮਾਡਲਾਂ ਵਿੱਚ ਵਰਤਣ ਲਈ ਸੁਵਿਧਾਜਨਕ ਹੈ।

ਰੀਅਲ ਟਾਈਮ ਪੀਸੀਆਰ ਕਿੱਟ-ਟੈਕਮੈਨ

ਕਮਜ਼ੋਰ ਹਾਈਡ੍ਰੋਜਨ ਬਾਂਡ ਦਾ ਇਲਾਜ: ਕਮਜ਼ੋਰ ਹਾਈਡ੍ਰੋਜਨ ਬਾਂਡ ਦਾ ਇਲਾਜ ਮੁਕਾਬਲਤਨ ਤਕਨੀਕੀ ਮਾਮਲਾ ਹੈ।ਕਈ ਕਿੱਟਾਂ ਦੇ ਮੈਨੂਅਲ ਪੜ੍ਹੇ ਹਨ, ਪਰ ਉਨ੍ਹਾਂ ਵਿੱਚੋਂ ਕਿਸੇ ਨੇ ਵੀ ਇਸ ਵਿਸ਼ੇ ਦਾ ਜ਼ਿਕਰ ਨਹੀਂ ਕੀਤਾ।ਅਸਲ ਵਿੱਚ, ਇਹ ਬਹੁਤ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਹੈ.ਆਧਾਰਾਂ ਦਾ ਸੁਮੇਲ ਮੁੱਖ ਤੌਰ 'ਤੇ ਹਾਈਡ੍ਰੋਜਨ ਬਾਂਡਾਂ ਦੀ ਤਾਕਤ 'ਤੇ ਨਿਰਭਰ ਕਰਦਾ ਹੈ।ਮਜ਼ਬੂਤ ​​ਹਾਈਡ੍ਰੋਜਨ ਬਾਂਡ ਆਮ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਹੁੰਦੇ ਹਨ, ਅਤੇ ਕਮਜ਼ੋਰ ਹਾਈਡ੍ਰੋਜਨ ਬਾਂਡ ਗੈਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਵੱਲ ਲੈ ਜਾਂਦੇ ਹਨ।ਜੇ ਕਮਜ਼ੋਰ ਹਾਈਡ੍ਰੋਜਨ ਬਾਂਡਾਂ ਨੂੰ ਚੰਗੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਖਤਮ ਨਹੀਂ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਤਾਂ ਗੈਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਤੋਂ ਬਚਿਆ ਨਹੀਂ ਜਾ ਸਕਦਾ।ਲੇਖਕ ਦੇ ਦਾਇਰੇ ਦੇ ਅੰਦਰ, ਸਿਰਫ ਕੁਝ ਕੰਪਨੀਆਂ ਨੇ ਇਸ ਸਮੱਸਿਆ ਨੂੰ ਦੇਖਿਆ ਹੈ.ਜਦੋਂ ਤੁਸੀਂ ਕਿੱਟ ਖਰੀਦਦੇ ਹੋ, ਤਾਂ ਤੁਸੀਂ ਇਸ ਗੱਲ ਦਾ ਹਵਾਲਾ ਦੇ ਸਕਦੇ ਹੋ ਕਿ ਕੀ ਤੁਸੀਂ ਕਿੱਟ ਲਈ ਇਸ ਸਬੰਧ ਵਿੱਚ ਕੋਈ ਹੱਲ ਚੁਣਿਆ ਹੈ ਜਾਂ ਨਹੀਂ।

ਪ੍ਰਤੀਕਿਰਿਆ ਵਾਲੀਅਮ: 20-50ul ਸਿਸਟਮ ਵਧੇਰੇ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਵਰਤਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਛੋਟੀਆਂ ਆਇਤਾਂ ਕਾਰਨ ਗਲਤੀਆਂ ਹੋਣ ਦੀ ਸੰਭਾਵਨਾ ਹੁੰਦੀ ਹੈ।ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਕਿੱਟ ਨਿਰਦੇਸ਼ ਪੀਸੀਆਰ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਵਾਲੀਅਮ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਦੀ ਸਿਫਾਰਸ਼ ਕਰਨਗੇ।ਹੁਸ਼ਿਆਰ ਨਾ ਬਣੋ ਅਤੇ ਲਾਗਤਾਂ ਨੂੰ ਬਚਾਉਣ ਲਈ ਛੋਟੀਆਂ ਮਾਤਰਾਵਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ।ਦਾ ਟੀਚਾ.ਵਪਾਰੀਆਂ ਦੁਆਰਾ ਸਿਫ਼ਾਰਸ਼ ਕੀਤੀ ਗਈ ਵਾਲੀਅਮ ਅਸਲ ਵਿੱਚ ਜਾਂਚ ਕੀਤੀ ਗਈ ਹੈ, ਅਤੇ ਇਹ ਹੋ ਸਕਦਾ ਹੈ ਕਿ ਉਹ ਛੋਟੇ ਵਾਲੀਅਮ ਦੇ ਕਾਰਨ ਹੋਣ ਵਾਲੀਆਂ ਗਲਤੀਆਂ ਦੀ ਸਮੱਸਿਆ ਨੂੰ ਹੱਲ ਨਾ ਕਰ ਸਕਣ।
2. ਟਿਊਬ ਪਲੇਟ ਦਾ ਨਿਰਮਾਤਾ ਅਤੇ ਲੇਖ ਨੰਬਰ
ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਮਾਤਰਾਤਮਕ ਪੀਸੀਆਰ ਦੇ ਸਿਧਾਂਤ ਨੂੰ ਹਰ ਕੋਈ ਜਾਣਦਾ ਹੈ।ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਸੰਗ੍ਰਹਿ ਮੁੱਖ ਤੌਰ 'ਤੇ ਪੀਸੀਆਰ ਟਿਊਬ ਕੈਪਸ ਦੁਆਰਾ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਪੀਸੀਆਰ ਖਪਤਕਾਰਾਂ ਦੀ ਚੋਣ ਕਰਦੇ ਸਮੇਂ, ਦੋ ਨੁਕਤਿਆਂ ਵੱਲ ਧਿਆਨ ਦਿਓ: ਚੰਗੀ ਰੋਸ਼ਨੀ ਪ੍ਰਸਾਰਣ ਅਤੇ ਸਾਧਨ ਲਈ ਢੁਕਵਾਂ।ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਮੁੱਖ ਧਾਰਾ ਦੇ ਬ੍ਰਾਂਡਾਂ ਦੇ ਬੋਰਡ ਅਤੇ ਟਿਊਬ ਵਧੀਆ ਹਨ, ਪਰ ਤੁਹਾਨੂੰ ਅਨੁਕੂਲਤਾ ਦੇ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਧਿਆਨ ਨਾਲ ਚੁਣਨਾ ਪਵੇਗਾ, ਨਹੀਂ ਤਾਂ ਤੁਸੀਂ ਸਾਧਨ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਨ ਦੇ ਯੋਗ ਨਹੀਂ ਹੋਵੋਗੇ।

4. ਸਿਖਰ ਪੱਧਰ ਦਾ ਗਿਆਨ

MIQE (8)-qPCR ਪ੍ਰਮਾਣਿਕਤਾ
ਇਹ qPCR ਦੀ ਪ੍ਰਮੁੱਖ ਤਰਜੀਹ ਹੈ!ਇਸ ਲਈ ਬਹੁਤ ਸਾਰੇ ਵੀਰ ਇੱਥੇ ਰੇਤ ਵਿੱਚ ਡਿੱਗ ਗਏ ਹਨ।ਬੇਸ਼ੱਕ, ਇਹ ਵੀ ਸੰਭਵ ਹੈ ਕਿ ਤੁਸੀਂ ਖੁਸ਼ਕਿਸਮਤ ਹੋ ਅਤੇ ਤੁਸੀਂ ਜਿਨ੍ਹਾਂ ਜੀਨਾਂ ਦਾ ਅਧਿਐਨ ਕੀਤਾ ਹੈ ਉਹ ਸਧਾਰਨ ਹਨ, ਇਸ ਲਈ ਤੁਸੀਂ ਹਵਾ ਦੇ ਨਾਲ ਬਰਫ਼ ਦੀ ਗੁਫਾ ਵਿੱਚ ਤੈਰਦੇ ਹੋ.QPCR ਦੀ ਤਸਦੀਕ ਜਾਣਕਾਰੀ ਦਾ ਉਦੇਸ਼ ਡੇਟਾ ਦੀ ਭਰੋਸੇਯੋਗਤਾ ਦੀ ਜਾਂਚ ਕਰਨਾ ਹੈ।ਅਸੀਂ ਲੋੜੀਂਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀਕਰਨ ਜਾਣਕਾਰੀ ਨੂੰ ਹੇਠਾਂ ਦਿੱਤੇ ਅਨੁਸਾਰ ਸੂਚੀਬੱਧ ਕਰਦੇ ਹਾਂ:

1. ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਟੈਸਟ
ਟੀਚਾ ਜੀਨ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਦੀ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਇਹ ਜਾਂਚ ਕੇ ਜਾਂਚ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ ਕਿ ਕੀ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਫੋਰਸਿਸ ਤਸਵੀਰ ਇੱਕ ਸਿੰਗਲ ਬੈਂਡ ਹੈ;ਕ੍ਰਮ ਤਸਦੀਕ;ਇਹ ਦੇਖਣ ਲਈ ਕਿ ਕੀ ਚੋਟੀ ਦਾ ਨਕਸ਼ਾ ਸਿੰਗਲ ਹੈ, ਪਿਘਲਣ ਵਾਲੀ ਕਰਵ;ਐਨਜ਼ਾਈਮ ਪਾਚਨ ਤਸਦੀਕ ਅਤੇ ਹੋਰ ਤਰੀਕੇ।
ਇੱਥੇ, ਅਸੀਂ ਟੀ 'ਤੇ ਧਿਆਨ ਕੇਂਦਰਿਤ ਕਰਦੇ ਹਾਂਉਹ ਪਿਘਲਣ ਵਾਲੇ ਕਰਵ ਦੀ ਵਿਧੀ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਗੈਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਪ੍ਰਸਾਰਣ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕਰਦਾ ਹੈ.ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਜਦੋਂ ਅਸੀਂ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਕਰਦੇ ਹਾਂ, ਉਤਪਾਦ ਦੇ ਟੁਕੜੇ ਦਾ ਆਕਾਰ 80-200bp ਦੀ ਰੇਂਜ ਵਿੱਚ ਹੋਣਾ ਜ਼ਰੂਰੀ ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਜੋ PCR ਉਤਪਾਦ ਦੇ ਪਿਘਲਣ ਦਾ ਤਾਪਮਾਨ 80-85 °C ਸੀਮਾ ਬਣਾਉਂਦਾ ਹੈ।ਇਸ ਲਈ, ਜੇਕਰ ਫੁਟਕਲ ਚੋਟੀਆਂ ਹਨ, ਤਾਂ ਹੋਰ ਗੈਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਉਤਪਾਦ ਹੋਣੇ ਚਾਹੀਦੇ ਹਨ;ਜੇਕਰ ਸਿਖਰ 80°C ਤੋਂ ਹੇਠਾਂ ਦਿਖਾਈ ਦਿੰਦਾ ਹੈ, ਤਾਂ ਇਸਨੂੰ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਡਾਇਮਰ ਮੰਨਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ;ਜੇ ਸਿਖਰ 85 ਡਿਗਰੀ ਸੈਲਸੀਅਸ ਤੋਂ ਉੱਪਰ ਦਿਖਾਈ ਦਿੰਦਾ ਹੈ, ਤਾਂ ਇਸਨੂੰ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਡੀਐਨਏ ਗੰਦਗੀ ਜਾਂ ਵੱਡੇ ਟੁਕੜਿਆਂ ਦਾ ਵਧੇਰੇ ਗੈਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਵਾਧਾ ਮੰਨਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।
ਨੋਟ: ਕਈ ਵਾਰ 80 ਡਿਗਰੀ ਸੈਲਸੀਅਸ 'ਤੇ ਸਿਰਫ਼ ਇੱਕ ਹੀ ਸਿਖਰ ਹੁੰਦਾ ਹੈ।ਇਸ ਸਮੇਂ, ਇਸ ਸੰਕਲਪ ਦੀ ਪਾਲਣਾ ਕੀਤੀ ਜਾਣੀ ਚਾਹੀਦੀ ਹੈ.ਇਹ ਸੰਭਾਵਨਾ ਹੈ ਕਿ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਨਤੀਜੇ ਸਾਰੇ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਡਾਇਮਰ ਹਨ।

ਸਧਾਰਣ ਪਿਘਲਣ ਵਾਲੀ ਵਕਰ (ਬਿਨਾਂ ਗੈਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਪ੍ਰਸਾਰਣ ਦੇ ਨਾਲ ਸਿੰਗਲ ਪੀਕ)

ਸਮੱਸਿਆ ਵਾਲੀ ਪਿਘਲਣ ਵਾਲੀ ਵਕਰ (ਨਕਲੀ ਚੋਟੀਆਂ ਦਾ ਗੈਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਪ੍ਰਸਾਰ)
【ਕੇਸ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ】

ਇੱਕ ਮੁੱਖ ਸਿਖਰ ਹੈ, ਪਰ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਡਾਇਮਰ ਗੰਭੀਰ ਹੈ
ਹੇਠਾਂ ਦਿੱਤੇ ਚਿੱਤਰ ਵਿੱਚ ਸਿੰਗਲ-ਪੀਕ ਪਿਘਲਣ ਵਾਲਾ ਵਕਰ ਤੁਹਾਡੀਆਂ ਅੱਖਾਂ ਨੂੰ ਆਸਾਨੀ ਨਾਲ ਧੋਖਾ ਦੇ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਇਹ ਸੋਚ ਕੇ ਕਿ ਇਹ ਇੱਕ ਸੰਪੂਰਨ ਪ੍ਰਯੋਗ ਹੈ, ਪਰ ਨਤੀਜਾ ਪੂਰੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਗਲਤ ਹੈ।ਇਸ ਸਮੇਂ, ਸਾਨੂੰ ਪਿਘਲਣ ਦੇ ਤਾਪਮਾਨ ਨੂੰ ਵੇਖਣਾ ਪਏਗਾ.ਸਿਖਰ ਦਾ ਤਾਪਮਾਨ 80 ਡਿਗਰੀ ਸੈਲਸੀਅਸ ਤੋਂ ਘੱਟ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ ਪੂਰੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਪ੍ਰਾਈਮਰ-ਡਾਇਮਰ ਹੈ।

ਕੋਈ ਨਿਸ਼ਾਨਾ ਟੁਕੜਾ ਨਹੀਂ, ਸਾਰੇ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਡਾਇਮਰ
ਇੱਥੇ, ਮੇਰਾ ਭਰਾ ਰੁਕ ਨਹੀਂ ਸਕਦਾ।ਹੇਠਾਂ ਦਿੱਤੀ ਤਸਵੀਰ ਇੱਕ ਮੋਬਾਈਲ ਫੋਨ ਨਾਲ ਲਈ ਗਈ ਇੱਕ ਫੋਟੋ ਹੈ ਜੋ ਮੈਨੂੰ ਇੱਕ ਬਦਮਾਸ਼ ਦੁਆਰਾ ਭੇਜੀ ਗਈ ਹੈ।ਉਸ ਦੁਆਰਾ ਵਰਤੇ ਗਏ ਰੀਐਜੈਂਟਸ ਉਦਯੋਗ ਵਿੱਚ ਸਾਰੇ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਵਰਤੇ ਜਾਂਦੇ ਬ੍ਰਾਂਡ ਹਨ।ਉਹ ਇੱਕ ਟੀ-ਅਗੇਤਰ ਬ੍ਰਾਂਡ ਤੋਂ ਦੂਜੇ ਟੀ-ਅਗੇਤਰ ਬ੍ਰਾਂਡ ਵਿੱਚ ਬਦਲ ਗਿਆ।ਮੈਨੂੰ ਲਗਦਾ ਹੈ ਕਿ ਤੁਸੀਂ ਪਹਿਲਾਂ ਹੀ ਇਸਦਾ ਅੰਦਾਜ਼ਾ ਲਗਾ ਲਿਆ ਹੈ।ਬਦਮਾਸ਼ ਨੇ ਮੈਨੂੰ ਰੋਇਆ: “ਪਹਿਲੀ ਤਸਵੀਰ ਵਿੱਚ ਵਰਤਿਆ ਗਿਆ ਰੀਐਜੈਂਟ ਬਹੁਤ ਵਧੀਆ ਹੈ, ਅਤੇ ਸਿਖਰ ਸਿੰਗਲ ਹੈ।ਬਾਅਦ ਵਿੱਚ, ਤੁਹਾਡੇ ਦੁਆਰਾ ਸਿਫਾਰਸ਼ ਕੀਤੇ ਗਏ ਰੀਐਜੈਂਟ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਇਹ ਮਿਸ਼ਰਤ ਚੋਟੀਆਂ ਦੇ ਨਾਲ, ਦੂਜੀ ਤਸਵੀਰ ਵਾਂਗ ਬਣ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਤੂੰ ਮੈਨੂੰ ਦੁਖੀ ਕਰ ਦਿੱਤਾ ਹੈ।"
ਦੋ ਗ੍ਰਾਫਾਂ ਨੂੰ ਵੱਖ ਕਰੋ।ਪਹਿਲੀ ਨਜ਼ਰ ਵਿੱਚ, ਇੱਕ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਸਿੰਗਲ ਪੀਕ ਹੈ, ਅਤੇ ਦੂਜੀ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਡਬਲ ਪੀਕ ਹੈ।ਬਕਵਾਸ, ਇੱਕ ਸਿੰਗਲ ਪੀਕ ਜ਼ਰੂਰ ਠੀਕ ਹੈ.ਕੀ ਇਹ ਸੱਚ ਹੈ?
ਡੂ ਈ ਨਾਲੋਂ ਵੀ ਮਾੜਾ, ਜੇ ਮੈਂ ਹੇਠਾਂ ਤਸਵੀਰ ਵਿਚ ਦੋ ਤਸਵੀਰਾਂ ਪਾ ਦੇਵਾਂ, ਤਾਂ ਤੁਸੀਂ ਤੁਰੰਤ ਸਮਝ ਜਾਓਗੇ.ਅਸਲ ਵਿੱਚ, ਅਸੀਂ ਇਸ ਕਿਸਮ ਦੀ ਤਸਵੀਰ ਦੁਆਰਾ ਆਸਾਨੀ ਨਾਲ ਅਧਰੰਗ ਹੋ ਜਾਂਦੇ ਹਾਂ.ਧਿਆਨ ਨਾਲ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕਰਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਅਸੀਂ ਪਾਇਆ ਕਿ: ਪਹਿਲੇ ਚਿੱਤਰ ਦੀ ਸਿਖਰ 75°C 'ਤੇ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ ਪੂਰੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਡਾਇਮਰ ਹੈ;ਦੂਜੇ ਅੰਕੜੇ ਦਾ ਸਿਖਰ 75°C ਅਤੇ 82°C 'ਤੇ ਦਿਖਾਈ ਦਿੰਦਾ ਹੈ, ਘੱਟੋ-ਘੱਟ ਉੱਥੇ ਉਤਪਾਦ ਦਿਖਾਈ ਦਿੰਦੇ ਹਨ।

ਵਿਦਿਆਰਥੀਆਂ ਤੋਂ ਫੀਡਬੈਕ ਦੀਆਂ ਤਸਵੀਰਾਂ
ਇਸ ਲਈ ਬੁਨਿਆਦੀ ਸਮੱਸਿਆ ਰੀਐਜੈਂਟਸ ਦੀ ਸਮੱਸਿਆ ਨਹੀਂ ਹੈ, ਪਰ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਦੀ ਸਮੱਸਿਆ ਹੈ।ਇਸ ਦੇ ਨਾਲ ਹੀ, ਇਹ ਇਹ ਵੀ ਸਾਬਤ ਕਰਦਾ ਹੈ ਕਿ ਕੁਝ ਵੱਡੇ ਬ੍ਰਾਂਡ ਲੋਹੇ ਦੀ ਗੁਣਵੱਤਾ ਦੇ ਨਹੀਂ ਹਨ, ਅਤੇ ਇਹ ਵੀ ਸਾਬਤ ਕਰਦਾ ਹੈ ਕਿ ਮੇਰੇ ਭਰਾ ਨੇ ਪਹਿਲਾਂ ਕੀ ਕਿਹਾ ਸੀ: ਇਹ ਰੀਐਜੈਂਟ ਬ੍ਰਾਂਡ ਨਹੀਂ ਹੈ ਜੋ ਤੁਹਾਡੇ ਲੇਖ ਦਾ ਸਮਰਥਨ ਕਰਦਾ ਹੈ.ਇਹ ਤੁਹਾਡਾ ਲੇਖ ਹੈ ਜਿਸ ਨੇ ਰੀਐਜੈਂਟਸ ਦੇ ਬ੍ਰਾਂਡ ਨੂੰ ਅੱਗੇ ਵਧਾਇਆ।ਜ਼ਰਾ ਕਲਪਨਾ ਕਰੋ, ਜੇ ਸਕੂਮਬੈਗ ਨੇ ਰੀਐਜੈਂਟਸ ਨੂੰ ਨਾ ਬਦਲਿਆ, ਤਾਂ ਗਲਤ ਡੇਟਾ ਜਰਨਲ ਨੂੰ ਭੇਜਿਆ ਜਾਵੇਗਾ, ਅਤੇ ਜੋ ਵਾਪਰੇਗਾ ਉਹ ਇੱਕ ਦੁਖਾਂਤ ਹੋਵੇਗਾ.
2. ਖਾਲੀ ਨਿਯੰਤਰਣ ਦਾ Ct ਮੁੱਲ
ਵਿਆਖਿਆ ਨਾ ਕਰੋ, ਜੇਕਰ ਖਾਲੀ ਕੰਟਰੋਲ ਦਾ ਇੱਕ Ct ਮੁੱਲ ਹੈ, ਤਾਂ ਕੀ ਇਹ ਪ੍ਰਦੂਸ਼ਣ ਨਹੀਂ ਹੈ?ਹਾਲਾਂਕਿ, ਤੁਹਾਨੂੰ ਅਜੇ ਵੀ ਇਹ ਸਮਝਣ ਦੀ ਜ਼ਰੂਰਤ ਹੈ ਕਿ ਕਿਹੜੇ ਖਾਲੀ ਨਿਯੰਤਰਣ ਵਿੱਚ ਇੱਕ Ct ਮੁੱਲ ਹੈ.ਜੇ ਇਹ NTC ਹੈ, ਤਾਂ ਇਸਦਾ ਮਤਲਬ ਹੈ ਕਿ ਵਿਦੇਸ਼ੀ ਡੀਐਨਏ ਹੈ ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਰੀਐਜੈਂਟ ਗੰਦਗੀ.ਜੇਕਰ ਇਹ NRT ਹੈ, ਤਾਂ ਇਸਦਾ ਮਤਲਬ ਹੈ ਕਿ ਕੱਢੇ ਗਏ RNA ਵਿੱਚ DNA ਗੰਦਗੀ ਹੈ।
3. ਮਿਆਰੀ ਕਰਵ
ਢਲਾਨ ਅਤੇ ਗਣਨਾ ਫਾਰਮੂਲੇ ਸਮੇਤ, PCR ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਦੀ ਗਣਨਾ ਫਾਰਮੂਲੇ ਦੁਆਰਾ ਕੀਤੀ ਜਾ ਸਕਦੀ ਹੈ।ਇੱਕ ਸੰਪੂਰਣ ਪ੍ਰਯੋਗ ਲਈ 3.32 ਤੱਕ ਪਹੁੰਚਣ ਲਈ ਸਟੈਂਡਰਡ ਕਰਵ ਦੀ ਢਲਾਣ ਅਤੇ 0.9999 ਤੱਕ ਪਹੁੰਚਣ ਲਈ R² ਦੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ।
4. ਰੇਖਿਕ ਗਤੀਸ਼ੀਲ ਰੇਂਜ
ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਦੀ ਗਤੀਸ਼ੀਲ ਰੇਂਜ ਰੇਖਿਕ ਹੈ।ਸਟੈਂਡਰਡ ਕਰਵ ਬਣਾਉਣ ਲਈ ਵਰਤੇ ਗਏ ਟੈਂਪਲੇਟ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ, ਗਤੀਸ਼ੀਲ ਰੇਂਜ ਵਿੱਚ ਘੱਟੋ-ਘੱਟ 5 ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਗਰੇਡੀਐਂਟ ਸ਼ਾਮਲ ਹੋਣੇ ਚਾਹੀਦੇ ਹਨ, ਅਤੇ ਉੱਚ ਸੰਘਣਤਾ ਗਰੇਡੀਐਂਟ ਅਤੇ ਘੱਟ ਸੰਘਣਤਾ ਗਰੇਡੀਐਂਟ 'ਤੇ Ct ਮੁੱਲਾਂ ਦੇ ਬਦਲਾਅ ਵੱਲ ਧਿਆਨ ਦੇਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ।
5. ਖੋਜ ਦੀ ਸ਼ੁੱਧਤਾ
qPCR ਨਤੀਜਿਆਂ ਵਿੱਚ ਤਬਦੀਲੀਆਂ, ਯਾਨਿ, ਮਾੜੀ ਦੁਹਰਾਉਣਯੋਗਤਾ, ਯਾਨੀ ਕਿ, ਮਾੜੀ ਸ਼ੁੱਧਤਾ, ਤਾਪਮਾਨ, ਇਕਾਗਰਤਾ, ਅਤੇ ਸੰਚਾਲਨ ਸਮੇਤ ਬਹੁਤ ਸਾਰੇ ਕਾਰਕਾਂ ਕਰਕੇ ਹੁੰਦੀ ਹੈ।qPCR ਸ਼ੁੱਧਤਾ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਘੱਟ ਨਿਯੰਤਰਣਯੋਗ ਬਣ ਜਾਂਦੀ ਹੈ ਕਿਉਂਕਿ ਕਾਪੀ ਨੰਬਰ ਘਟਦਾ ਹੈ।ਆਦਰਸ਼ਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਪਰਿਵਰਤਨ ਦੇ ਅੰਦਰ, ਇਹ ਤਕਨੀਕੀ ਪਰਿਵਰਤਨ ਜੈਵਿਕ ਪਰਿਵਰਤਨ ਤੋਂ ਵੱਖਰਾ ਹੋਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਜੀਵ-ਵਿਗਿਆਨਕ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਤੀਆਂ ਸਮੂਹਾਂ ਜਾਂ ਇਲਾਜਾਂ ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ qPCR ਨਤੀਜਿਆਂ ਵਿੱਚ ਅੰਕੜਿਆਂ ਦੇ ਅੰਤਰ ਨੂੰ ਸਿੱਧੇ ਤੌਰ 'ਤੇ ਸੰਬੋਧਿਤ ਕਰ ਸਕਦੀਆਂ ਹਨ।ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਤੌਰ 'ਤੇ ਡਾਇਗਨੌਸਟਿਕ ਅਸੈਸ ਲਈ, ਸਾਈਟਾਂ ਅਤੇ ਓਪਰੇਟਰਾਂ ਵਿੱਚ ਸਭ ਤੋਂ ਵਧੀਆ ਅੰਤਰ-ਪਰਖ ਸ਼ੁੱਧਤਾ (ਦੁਹਰਾਉਣਯੋਗਤਾ) ਦੀ ਰਿਪੋਰਟ ਕੀਤੀ ਜਾਣੀ ਚਾਹੀਦੀ ਹੈ।
6. ਖੋਜ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਅਤੇ LOD (ਮਲਟੀਪਲੈਕਸ qPCR ਵਿੱਚ)
LOD ਖੋਜੇ ਗਏ ਸਕਾਰਾਤਮਕ ਨਮੂਨਿਆਂ ਵਿੱਚੋਂ 95% ਦੀ ਸਭ ਤੋਂ ਘੱਟ ਤਵੱਜੋ ਹੈ।ਦੂਜੇ ਸ਼ਬਦਾਂ ਵਿੱਚ, ਟੀਚੇ ਦੇ ਜੀਨ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਤੀਆਂ ਦੇ ਇੱਕ ਸਮੂਹ ਦੇ ਅੰਦਰ ਮੌਜੂਦ LOD ਦੀ ਤਵੱਜੋ ਅਸਫਲ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਦੇ 5% ਤੋਂ ਵੱਧ ਨਹੀਂ ਹੋਣੀ ਚਾਹੀਦੀ।ਮਲਟੀਪਲੈਕਸ qPCR ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕਰਦੇ ਸਮੇਂ, ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ ਬਿੰਦੂ ਪਰਿਵਰਤਨ ਜਾਂ ਪੋਲੀਮੋਰਫਿਜ਼ਮ ਦੀ ਸਮਕਾਲੀ ਖੋਜ ਲਈ, ਮਲਟੀਪਲੈਕਸ qPCR ਨੂੰ ਇਹ ਸਬੂਤ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰਨ ਦੀ ਜ਼ਰੂਰਤ ਹੁੰਦੀ ਹੈ ਕਿ ਇੱਕੋ ਟਿਊਬ ਵਿੱਚ ਮਲਟੀਪਲ ਟੀਚੇ ਦੇ ਟੁਕੜਿਆਂ ਦੀ ਸ਼ੁੱਧਤਾ ਨਾਲ ਸਮਝੌਤਾ ਨਹੀਂ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ, ਮਲਟੀਪਲ ਖੋਜ ਅਤੇ ਸਿੰਗਲ ਟਿਊਬ ਖੋਜ ਦੀ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਅਤੇ LOD ਇੱਕੋ ਜਿਹੇ ਹੋਣੇ ਚਾਹੀਦੇ ਹਨ।ਖ਼ਾਸਕਰ ਜਦੋਂ ਉੱਚ-ਇਕਾਗਰਤਾ ਵਾਲੇ ਟੀਚੇ ਵਾਲੇ ਜੀਨਾਂ ਅਤੇ ਘੱਟ-ਇਕਾਗਰਤਾ ਵਾਲੇ ਟੀਚੇ ਵਾਲੇ ਜੀਨਾਂ ਨੂੰ ਇੱਕੋ ਸਮੇਂ ਵਧਾਇਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਤਾਂ ਇਸ ਸਮੱਸਿਆ ਵੱਲ ਧਿਆਨ ਦਿੱਤਾ ਜਾਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ।
ਸਮੱਸਿਆਵਾਂ ਅਤੇ ਹੱਲਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ, qPCR ਡੀਬੱਗਿੰਗ ਵਿੱਚ ਅਕਸਰ ਆਉਣ ਵਾਲੀਆਂ ਸਮੱਸਿਆਵਾਂ ਹੇਠਾਂ ਦਿੱਤੇ ਪਹਿਲੂਆਂ 'ਤੇ ਫੋਕਸ ਕਰਦੀਆਂ ਹਨ:
· ਗੈਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਵਾਧਾ
· ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਦੀ ਮੁਸ਼ਕਲ ਚੋਣ ਅਤੇ ਪ੍ਰਾਈਮਰ-ਡਾਇਮਰ ਨਾਲ ਸਮੱਸਿਆ
· ਐਨੀਲਿੰਗ ਤਾਪਮਾਨ ਗਲਤ ਹੈ
· ਸੈਕੰਡਰੀ ਬਣਤਰ ਐਂਪਲੀਫੀਕੇਸ਼ਨ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਨੂੰ ਪ੍ਰਭਾਵਿਤ ਕਰਦੀ ਹੈ
ਗੈਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਵਾਧਾ
ਗੈਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਵਾਧਾਵਾਪਰਦਾ ਹੈ, ਇਹ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਮੰਨਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਕੀ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਢੁਕਵਾਂ ਨਹੀਂ ਹੈ, ਪਰ ਜੇਕਰ ਤੁਸੀਂ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਨੂੰ ਬਦਲਣ ਦੀ ਕਾਹਲੀ ਵਿੱਚ ਨਹੀਂ ਹੋ, ਤਾਂ ਤੁਸੀਂ ਪਹਿਲਾਂ ਹੇਠਾਂ ਦਿੱਤੇ ਤਰੀਕਿਆਂ ਦੀ ਕੋਸ਼ਿਸ਼ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹੋ (ਸਿਧਾਂਤ ਵੀ ਜੁੜਿਆ ਹੋਇਆ ਹੈ):
· ਐਨੀਲਿੰਗ ਤਾਪਮਾਨ ਨੂੰ ਵਧਾਓ - ਕਮਜ਼ੋਰ ਹਾਈਡ੍ਰੋਜਨ ਬਾਂਡਾਂ ਨੂੰ ਕਾਇਮ ਰੱਖਣ ਵਿੱਚ ਅਸਮਰੱਥ ਬਣਾਉਣ ਦੀ ਕੋਸ਼ਿਸ਼ ਕਰੋ;
· ਐਨੀਲਿੰਗ ਅਤੇ ਲੰਬਾਈ ਦਾ ਸਮਾਂ ਛੋਟਾ ਕਰੋ - ਕਮਜ਼ੋਰ ਹਾਈਡ੍ਰੋਜਨ ਬਾਂਡ ਦੀ ਸੰਭਾਵਨਾ ਨੂੰ ਘਟਾਓ;
· ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਨੂੰ ਘਟਾਓ - ਬੇਲੋੜੇ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਅਤੇ ਗੈਰ-ਨਿਸ਼ਾਨਾ ਖੇਤਰਾਂ ਦੇ ਬਾਈਡਿੰਗ ਦੀ ਸੰਭਾਵਨਾ ਨੂੰ ਘਟਾਓ;
ਘੱਟ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਕੁਸ਼ਲਤਾ
ਗੈਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਦੀ ਉਲਟ ਸਥਿਤੀ - ਘੱਟ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਕੁਸ਼ਲਤਾ, ਅਤੇ ਘੱਟ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਨਾਲ ਨਜਿੱਠਣ ਦੇ ਉਪਾਅ ਬਿਲਕੁਲ ਉਲਟ ਹਨ:
· ਐਨੀਲਿੰਗ ਅਤੇ ਲੰਬਾਈ ਦੇ ਸਮੇਂ ਨੂੰ ਲੰਮਾ ਕਰੋ;
· ਤਿੰਨ-ਪੜਾਅ ਵਾਲੇ ਪੀਸੀਆਰ ਵਿੱਚ ਬਦਲੋ ਅਤੇ ਐਨੀਲਿੰਗ ਤਾਪਮਾਨ ਨੂੰ ਘਟਾਓ;
· ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਦੀ ਇਕਾਗਰਤਾ ਨੂੰ ਵਧਾਓ;
Ps: 90 ਦੇ ਦਹਾਕੇ ਵਿੱਚ ਪੈਦਾ ਹੋਏ ਬਹੁਤ ਸਾਰੇ ਗ੍ਰੈਜੂਏਟ ਵਿਦਿਆਰਥੀ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਨੂੰ ਡੀਬੱਗ ਕਰਨ ਦੇ ਤਰੀਕੇ ਦਾ ਅਧਿਐਨ ਕਰਨ ਲਈ ਤਿਆਰ ਨਹੀਂ ਹਨ, ਅਤੇ ਉਮੀਦ ਕਰਦੇ ਹਨ ਕਿ ਕਿੱਟ ਸਮੱਸਿਆ ਨੂੰ ਪੂਰੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਹੱਲ ਕਰ ਸਕਦੀ ਹੈ (ਜੇ ਤੁਸੀਂ ਗ੍ਰੈਜੂਏਸ਼ਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਖੋਜ ਅਤੇ ਵਿਕਾਸ ਕਰਨ ਲਈ ਇੱਕ ਰੀਐਜੈਂਟ ਕੰਪਨੀ ਵਿੱਚ ਜਾਣਾ ਚਾਹੁੰਦੇ ਹੋ), ਅਸਲ ਵਿੱਚ, ਰੀਐਜੈਂਟ ਨਿਰਮਾਤਾ ਵੀ ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ ਸੋਚਦੇ ਹਨ, ਮੈਂ ਉਮੀਦ ਕਰਦਾ ਹਾਂ ਕਿ ਇਹ ਇੱਕ ਬੇਵਕੂਫੀ ਹੈ ਜਦੋਂ ਤੁਸੀਂ ਇਸਨੂੰ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਦੇ ਹੋ ਤਾਂ ਇਸਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਜਾ ਸਕਦੀ ਹੈ। ਕਮਜ਼ੋਰ ਐੱਚ-ਬਾਂਡ ਸੋਖਣ ਕਾਰਕਾਂ ਦੀ ਜਾਣ-ਪਛਾਣ।ਸਮੱਸਿਆ ਨੂੰ ਆਸਾਨੀ ਨਾਲ ਹੱਲ ਕਰਨ ਲਈ, ਮੂਰਖਾਂ ਨੂੰ ਅਜੇ ਵੀ ਰੀਐਜੈਂਟ ਕੰਪਨੀ ਦੀ ਜਾਣ-ਪਛਾਣ ਨੂੰ ਪੜ੍ਹਨਾ ਪੈਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਕੀ ਕੋਈ ਅਜਿਹਾ ਕਾਰਕ ਹੈ ਜੋ ਕਮਜ਼ੋਰ ਹਾਈਡ੍ਰੋਜਨ ਬਾਂਡਾਂ ਨੂੰ ਜਜ਼ਬ ਕਰਦਾ ਹੈ।
ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਦੀ ਮੁਸ਼ਕਲ ਚੋਣ ਅਤੇ ਪ੍ਰਾਈਮਰ-ਡਾਇਮਰ ਨਾਲ ਸਮੱਸਿਆ
ਵਿਧੀ 1: ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ, qPCR ਲਈ ਕਿੱਟ ਨਿਰਦੇਸ਼ਾਂ ਵਿੱਚ ਸਿਫ਼ਾਰਸ਼ ਕੀਤੇ ਸਿਸਟਮ ਅਤੇ ਸਿਫ਼ਾਰਸ਼ ਕੀਤੇ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਹਨ।
ਢੰਗ 2: ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਗਰੇਡੀਐਂਟ ਸੈੱਟ ਕਰਕੇ ਡੀਬੱਗ ਕਰਨਾ।ਹੇਠਾਂ ਦਿੱਤੀ ਤਸਵੀਰ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਣ ਲਈ ਇੱਕ ਕੰਪਨੀ ਤੋਂ ਚੋਰੀ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ।ਹੇਠਾਂ ਦਿੱਤਾ ਚਿੱਤਰ ਤਿੰਨ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਗਰੇਡੀਐਂਟ (100nM, 250nM, 500nM) ਅਤੇ ਚਾਰ ਟੈਂਪਲੇਟ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਗਰੇਡੀਐਂਟ (0.1ng, 1ng, 10ng, 100ng) ਨਾਲ ਬਣੇ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਮਾਤਰਾਤਮਕ ਨਤੀਜੇ ਦਿਖਾਉਂਦਾ ਹੈ।ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਨਤੀਜਿਆਂ ਦਾ Ct ਮੁੱਲ ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ ਤਿਆਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ:

ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਇਕਾਗਰਤਾ ਚੋਣ ਹਰੇਕ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਇਕਾਗਰਤਾ ਨੂੰ ਹੇਠ ਲਿਖੇ ਅਨੁਸਾਰ ਇੱਕ ਲਾਈਨ ਵਿੱਚ ਜੋੜੋ:

ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਦੀ ਚੋਣ ਸਪੱਸ਼ਟ ਹੈ, 100nM ਅਤੇ 250nM ਦੀ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਦਾ ਰੇਖਿਕ ਸਬੰਧ ਬਿਹਤਰ ਹੈ, ਅਤੇ 500nM ਦੀ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਦਾ ਰੇਖਿਕ ਸਬੰਧ ਮੁਕਾਬਲਤਨ ਮਾੜਾ ਹੈ।100nM ਅਤੇ 250nM ਵਿੱਚ, 250nM ਦਾ Ct ਮੁੱਲ ਮੁਕਾਬਲਤਨ ਛੋਟਾ ਹੈ, ਇਸਲਈ ਸਰਵੋਤਮ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ 250nM ਹੈ।ਪਿਘਲਣ ਵਾਲੀ ਵਕਰ ਵਿੱਚ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਗੰਭੀਰ ਪ੍ਰਾਈਮਰ-ਡਾਇਮਰ ਦੇਖੇ ਜਾ ਸਕਦੇ ਹਨ।ਉਦੋਂ ਕੀ ਜੇ ਡਿਜ਼ਾਇਨ ਕੀਤੇ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਪ੍ਰਾਈਮਰ-ਡਾਇਮਰ ਤੋਂ ਬਚ ਨਹੀਂ ਸਕਦੇ?
ਢੰਗ 3: ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਘਟਾਓ ਅਤੇ ਐਨੀਲਿੰਗ ਤਾਪਮਾਨ ਵਧਾਓ (ਸਮਝਾਉਣ ਦੀ ਲੋੜ ਨਹੀਂ)।
ਐਨੀਲਿੰਗ ਤਾਪਮਾਨ ਦਾ ਅਨੁਭਵੀ ਮੁੱਲ 60 ਡਿਗਰੀ ਸੈਲਸੀਅਸ ਹੈ।ਜੇ ਤੁਸੀਂ ਨਿਸ਼ਚਤ ਨਹੀਂ ਹੋ, ਤਾਂ ਇੱਕ ਹੋਰ ਢੁਕਵਾਂ ਐਨੀਲਿੰਗ ਤਾਪਮਾਨ ਕਿਵੇਂ ਚੁਣਨਾ ਹੈ?ਜਵਾਬ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਇਕਾਗਰਤਾ ਦੀ ਚੋਣ ਦੇ ਸਮਾਨ ਹੈ -ਗਰੇਡੀਐਂਟ ਟੈਸਟ.ਸਮੱਸਿਆ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਣ ਲਈ ਬਾਇਓ-ਰੈਡ ਕੰਪਨੀ ਤੋਂ ਇੱਕ ਤਸਵੀਰ ਲਓ।ਕਿਸੇ ਨਿਸ਼ਚਿਤ ਟੀਚੇ ਦੇ ਟੁਕੜੇ ਦੇ ਵਿਸਤਾਰ ਲਈ, ਅੱਠ ਤਾਪਮਾਨ ਗਰੇਡੀਐਂਟ ਸੈੱਟ ਕਰੋ, ਹਰੇਕ ਤਿੰਨ ਦੁਹਰਾਓ ਦੇ ਨਾਲ, ਅਤੇ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੀ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਕਰਵ ਹੇਠ ਲਿਖੇ ਅਨੁਸਾਰ ਹੈ:

ਐਨੀਲਿੰਗ ਤਾਪਮਾਨ ਦੀ ਚੋਣ:
· 70°C, 69°C—ਅਸਲ ਵਿੱਚ, ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਨੂੰ ਜੋੜਿਆ ਨਹੀਂ ਜਾ ਸਕਦਾ, ਇਸਲਈ ਕੋਈ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਨਹੀਂ ਹੈ।
· 67.3°C - ਸ਼ੁਰੂ ਵਿੱਚ ਥੋੜੀ ਮਾਤਰਾ ਵਿੱਚ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ Ct ਮੁੱਲ ਮੁਕਾਬਲਤਨ ਵੱਡਾ ਹੁੰਦਾ ਹੈ।
· 64.5°C——Ct ਮੁੱਲ ਘਟਦਾ ਹੈ।
· 60.7°C, 58.0°C, 56.2°C, ਅਤੇ 55.0°C 'ਤੇ, Ct ਮੁੱਲ ਮੂਲ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਸਥਿਰ ਹੁੰਦੇ ਸਨ, ਪਰ ਅੰਤਮ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਮੁੱਲ ਵੱਖਰੇ ਸਨ।
ਕਿਵੇਂ ਚੁਣਨਾ ਹੈ?ਸਿਧਾਂਤ: ਪਹਿਲਾ ਸਿਧਾਂਤ ਉੱਚ Ct ਮੁੱਲ ਹੈ।ਉਸੇ Ct ਮੁੱਲ ਲਈ, ਡਾਇਮੇਰਾਈਜ਼ੇਸ਼ਨ ਅਤੇ ਗੈਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਤੋਂ ਬਚਣ ਲਈ ਉੱਚ ਐਨੀਲਿੰਗ ਤਾਪਮਾਨ ਚੁਣੋ।ਹਾਲਾਂਕਿ 55°C 'ਤੇ ਇੱਕ ਉੱਚ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਮੁੱਲ ਹੈ, ਇਸ ਵਿੱਚ ਡਾਇਮਰ ਜਾਂ ਗੈਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਹੋ ਸਕਦੇ ਹਨ।
ਪਰ ਜੇਕਰ ਤੁਸੀਂ ਆਪਣੇ ਜਿੰਨੇ ਹੁਸ਼ਿਆਰ ਹੋ, ਤਾਂ ਤੁਸੀਂ ਨਿਸ਼ਚਤ ਤੌਰ 'ਤੇ ਸੋਚੋਗੇ: ਤਰਕਸ਼ੀਲ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਜੇ ਪੀਸੀਆਰ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਬਹੁਤ ਖਾਸ ਹੈ, ਜਦੋਂ ਤੱਕ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਦੀ ਇਕਾਗਰਤਾ ਘੱਟੋ-ਘੱਟ ਲੋੜ ਤੋਂ ਵੱਧ ਜਾਂਦੀ ਹੈ, ਉੱਚ ਅਤੇ ਨੀਵੇਂ ਬਿੰਦੂਆਂ ਦਾ ਕੋਈ ਪ੍ਰਭਾਵ ਨਹੀਂ ਹੋਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਰੰਗਾਂ ਅਤੇ dNTPs।ਦਰਅਸਲ, ਜਿੰਨਾ ਚਿਰ ਐਨੀਲਿੰਗ ਤਾਪਮਾਨ ਨੂੰ ਸਹੀ ਢੰਗ ਨਾਲ ਅਨੁਕੂਲ ਬਣਾਇਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, Ct ਮੁੱਲ 'ਤੇ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਦਾ ਪ੍ਰਭਾਵ ਕੁਦਰਤੀ ਤੌਰ 'ਤੇ ਘੱਟ ਕੀਤਾ ਜਾਵੇਗਾ।

ਐਨੀਲਿੰਗ ਤਾਪਮਾਨ ਨੂੰ ਸਹੀ ਢੰਗ ਨਾਲ ਅਨੁਕੂਲ ਬਣਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ, ਅਤੇ ਸੀਟੀ 'ਤੇ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਦੇ ਪ੍ਰਭਾਵ ਨੂੰ ਘੱਟ ਕੀਤਾ ਜਾਵੇਗਾ
ਸੈਕੰਡਰੀ ਬਣਤਰ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਨੂੰ ਪ੍ਰਭਾਵਿਤ ਕਰਦੀ ਹੈ
ਆਉ ਸਮੱਸਿਆ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਣ ਲਈ ਬਾਇਓ-ਰੈਡ ਤੋਂ ਤਸਵੀਰ ਲੈਂਦੇ ਹਾਂ।ਇਹ ਇੱਕ ਸੈਕੰਡਰੀ ਢਾਂਚੇ ਦੇ ਨਾਲ ਇੱਕ ਜੀਨ ਨੂੰ ਵਧਾਉਣ ਲਈ ਇੱਕ ਤਾਪਮਾਨ ਗਰੇਡੀਐਂਟ ਵੀ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਕਰਦਾ ਹੈ।

ਸੈਕੰਡਰੀ ਬਣਤਰ ਉਭਰਦਾ ਹੈ
ਇਹ ਦੇਖਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ ਕਿ ਜਿਵੇਂ ਹੀ ਤਾਪਮਾਨ ਗਰੇਡੀਐਂਟ ਘਟਦਾ ਹੈ, ਉਤਪਾਦ ਦਿਖਾਈ ਦੇਣ ਲੱਗ ਪੈਂਦੇ ਹਨ ਅਤੇ Ct ਮੁੱਲ ਅੱਗੇ ਵਧਦਾ ਹੈ, 60.7°C 'ਤੇ ਨਿਊਨਤਮ ਮੁੱਲ 'ਤੇ ਪਹੁੰਚਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਫਿਰ ਜਿਵੇਂ-ਜਿਵੇਂ ਤਾਪਮਾਨ ਢਾਲ ਘਟਦਾ ਹੈ, Ct ਮੁੱਲ ਵੱਡਾ ਹੋ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਇਸ ਦੇ ਉਲਟ, ਜਿਵੇਂ ਤਾਪਮਾਨ ਵਧਦਾ ਹੈ, ਸੈਕੰਡਰੀ ਢਾਂਚਾ ਖੁੱਲ੍ਹਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਵਧਦੀ ਹੈ।ਇੱਕ ਨਿਸ਼ਚਿਤ ਤਾਪਮਾਨ ਤੱਕ ਪਹੁੰਚਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਤਾਪਮਾਨ ਨੂੰ ਵਧਾਉਣਾ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਵਿੱਚ ਸੁਧਾਰ ਨਹੀਂ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਕਿਉਂਕਿ ਇਸ ਸਮੇਂ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਨੂੰ ਸਥਿਰਤਾ ਨਾਲ ਜੋੜਿਆ ਨਹੀਂ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਇਸ ਲਈ,ਸਭ ਤੋਂ ਘੱਟ Ct ਮੁੱਲ ਦੇ ਨਾਲ ਤਾਪਮਾਨ ਦੀ ਭਾਲ ਕਰੋ, ਜੋ ਕਿ ਸੈਕੰਡਰੀ ਬਣਤਰ ਟੈਮਪਲੇਟ ਨੂੰ ਵਧਾਉਣ ਲਈ ਸਭ ਤੋਂ ਵਧੀਆ ਤਾਪਮਾਨ ਹੈ!ਬੇਸ਼ੱਕ, ਚੁਸਤ ਮੂਰਖਾਂ ਨੂੰ ਇਹ ਪਤਾ ਹੋਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ ਕਿ ਜੇ ਇਹ ਜ਼ਰੂਰੀ ਨਹੀਂ ਹੈ, ਤਾਂ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਨੂੰ ਬਦਲਣਾ ਅਤੇ ਸੈਕੰਡਰੀ ਢਾਂਚੇ ਦੇ ਖੇਤਰ ਤੋਂ ਬਚਣਾ ਸਭ ਤੋਂ ਵਧੀਆ ਹੈ.
5. ਐਪਲੀਕੇਸ਼ਨ ਪੱਧਰ
MIQE—ਡਾਟਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ

ਡਾਟਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਮੁੱਖ ਤੌਰ 'ਤੇ ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਮਾਤਰਾਤਮਕ PCR ਸਾਧਨ ਦੁਆਰਾ ਦਿੱਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਪਿਛਲੇ ਲੇਖ ਵਿੱਚ, ਬਹੁਤ ਸਾਰੇ ਡੇਟਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਦਾ ਕੰਮ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਖਾਲੀ ਨਿਯੰਤਰਣ, ਜਿਸ ਨੂੰ ਪ੍ਰਯੋਗ ਦੇ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਵਿੱਚ ਸਮਝਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ।ਅੰਦਰੂਨੀ ਸੰਦਰਭ ਜੀਨਾਂ, ਦੁਹਰਾਓ ਸੰਖਿਆਵਾਂ ਆਦਿ ਨੂੰ ਸਪਸ਼ਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ., ਇੱਥੇ ਅਸੀਂ ਮੁੱਖ ਤੌਰ 'ਤੇ qPCR ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਦੀ ਵਿਆਖਿਆ ਕਰਦੇ ਹਾਂ।
qPCR ਵਿਆਪਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਵਰਤਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਤਸਦੀਕ ਅਤੇ ਨਿਊਕਲੀਕ ਐਸਿਡ ਨਿਦਾਨ ਸਭ ਤੋਂ ਵੱਧ ਵਰਤੇ ਜਾਣ ਵਾਲੇ ਦ੍ਰਿਸ਼ ਹਨ।
ਪੂਰਨ ਮਾਤਰਾ
ਲੌਗ (ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਇਕਾਗਰਤਾ) ਦਾ ਚੱਕਰਾਂ ਦੀ ਸੰਖਿਆ ਨਾਲ ਇੱਕ ਰੇਖਿਕ ਸਬੰਧ ਹੁੰਦਾ ਹੈ।ਜਾਣੇ-ਪਛਾਣੇ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਕਾਪੀ ਨੰਬਰ ਵਾਲੇ ਸਟੈਂਡਰਡ ਤੋਂ ਇੱਕ ਸਟੈਂਡਰਡ ਕਰਵ ਖਿੱਚਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਯਾਨੀ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਦਾ ਰੇਖਿਕ ਸਬੰਧ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਨਮੂਨੇ ਦੇ Ct ਮੁੱਲ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ, ਨਮੂਨੇ ਵਿੱਚ ਇਕਾਗਰਤਾ ਦੀ ਗਣਨਾ ਕੀਤੀ ਜਾ ਸਕਦੀ ਹੈ।ਸ਼ਾਮਲ ਕਰਨ ਲਈ ਟੈਂਪਲੇਟਾਂ ਦੀ ਮਾਤਰਾ।

ਸੰਪੂਰਨ ਮਾਤਰਾਤਮਕ ਗਣਨਾ ਵਿਧੀ
ਪੂਰਨ ਮਾਤਰਾ ਮਿਆਰੀ ਵਕਰ 'ਤੇ ਆਧਾਰਿਤ ਹੋਣੀ ਚਾਹੀਦੀ ਹੈ।ਇੱਕ ਮਿਆਰੀ ਕਰਵ ਬਣਾਉਣ ਲਈ, ਇੱਕ ਮਿਆਰ ਦੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ।ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਸਟੈਂਡਰਡ ਇੱਕ ਪਲਾਜ਼ਮੀਡ ਹੁੰਦਾ ਹੈ ਜੋ ਟੀਚੇ ਦੇ ਜੀਨ ਨੂੰ ਕਲੋਨ ਕਰਕੇ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਇਹ ਪਲਾਜ਼ਮੀਡ ਕਿਉਂ ਹੈ?ਕਿਉਂਕਿ ਗੋਲ ਪਲਾਜ਼ਮੀਡ ਡੀਐਨਏ ਸਭ ਤੋਂ ਸਥਿਰ ਹੈ।ਮਿਆਰੀ ਉਤਪਾਦ ਨੂੰ ਦੁੱਗਣਾ ਅਨੁਪਾਤ (10 ਗੁਣਾ ਪਤਲਾ) ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ 5 ਤੋਂ 6 ਗਰੇਡੀਐਂਟ ਵਿੱਚ ਪਤਲਾ ਕਰੋ, ਅਤੇ ਪਤਲਾ ਕਰਨ ਵੇਲੇ ਇਕਸਾਰਤਾ ਵੱਲ ਧਿਆਨ ਦਿਓ।Ct ਮੁੱਲ ਨੂੰ 15-30 ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਡਿੱਗਣ ਦਿਓ।

ਮਿਆਰੀ ਤਿਆਰੀ
ਇਸ ਦੇ ਨਾਲ ਹੀ, ਟੈਸਟ ਕੀਤੇ ਜਾਣ ਵਾਲੇ ਨਮੂਨੇ ਨੂੰ ਵੀ ਉਸੇ ਅਨੁਸਾਰ ਪਤਲਾ ਕੀਤਾ ਜਾਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ (ਪਤਲੇਪਣ ਕਾਰਕ ਨੂੰ ਯਾਦ ਰੱਖੋ), ਅਤੇ Ct ਮੁੱਲ ਵੀ 15-30 ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਹੋਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ।ਮਿਆਰੀ ਉਤਪਾਦ + ਟੈਸਟ ਕੀਤੇ ਜਾਣ ਵਾਲੇ ਨਮੂਨੇ ਨੂੰ ਇਕੱਠੇ ਮਸ਼ੀਨ 'ਤੇ ਰੱਖਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਦੌੜਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਮਿਆਰੀ ਪਦਾਰਥ ਨਾਲ ਇੱਕ ਮਿਆਰੀ ਕਰਵ ਬਣਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਜਾਂਚ ਕੀਤੇ ਜਾਣ ਵਾਲੇ ਨਮੂਨਿਆਂ ਨੂੰ ਇਕਾਗਰਤਾ ਦੀ ਗਣਨਾ ਕਰਨ ਲਈ ਮਿਆਰੀ ਕਰਵ ਵਿੱਚ ਲਿਆਂਦਾ ਗਿਆ ਸੀ।
ਹੈਪੇਟਾਈਟਸ ਬੀ ਵਾਇਰਸ ਐਚ.ਬੀ.ਵੀ. ਮਾਪਦੰਡ ਇੱਕ ਖਾਸ ਸੰਪੂਰਨ ਮਾਤਰਾ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ ਖੂਨ ਦੇ 1 ਮਿ.ਲੀ. ਵਿੱਚ ਵਾਇਰਸ ਕਾਪੀ ਨੰਬਰ ਦੀ ਗਣਨਾ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ।
ਕਾਪੀ ਨੰਬਰ ਦੀ ਗਣਨਾ
ਟੈਸਟ ਕੀਤੇ ਜਾਣ ਵਾਲੇ ਨਮੂਨੇ ਦੀ ਇਕਾਗਰਤਾ (ng/ul) = OD260 × 50ug/ml × ਪਤਲਾ ਕਾਰਕ
ਨਮੂਨਾ ਅਣੂ ਭਾਰ = ਬੇਸਾਂ ਦੀ ਸੰਖਿਆ × 324
ਟੈਸਟ ਕੀਤੇ ਜਾਣ ਵਾਲੇ ਨਮੂਨੇ ਦੀ ਕਾਪੀ ਨੰਬਰ (ਕਾਪੀਆਂ/ਉਲ) = ਟੈਸਟ ਕੀਤੇ ਜਾਣ ਵਾਲੇ ਨਮੂਨੇ ਦੀ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ / ਨਮੂਨੇ ਦਾ ਅਣੂ ਭਾਰ × 6 × 1014

ਕਾਪੀ ਨੰਬਰ ਦੀ ਗਣਨਾ ਵਿਧੀ

ਉਪਰੋਕਤ ਮਾਤਰਾ ਨੂੰ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨ ਲਈ ਗਣਨਾ ਵਿਧੀ ਹੈ।ਇਹ ਇੱਕ ਗਣਿਤ ਦੀ ਸਮੱਸਿਆ ਹੈ ਜੋ ਜੂਨੀਅਰ ਹਾਈ ਸਕੂਲ ਤੋਂ ਗ੍ਰੈਜੂਏਟ ਹੋਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਹੱਲ ਕੀਤੀ ਜਾ ਸਕਦੀ ਹੈ, ਅਤੇ ਗਣਿਤ ਦੀਆਂ ਸਮੱਸਿਆਵਾਂ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਕੰਪਿਊਟਰਾਂ ਦੁਆਰਾ ਹੱਲ ਕੀਤੀਆਂ ਜਾਂਦੀਆਂ ਹਨ।ਜੇਕਰ ਤੁਹਾਨੂੰ ਸਮਝ ਨਹੀਂ ਆਉਂਦੀ, ਤਾਂ ਤੁਸੀਂ ਗੱਲਬਾਤ ਕਰਨ ਲਈ ਆ ਸਕਦੇ ਹੋ।
ਰਿਸ਼ਤੇਦਾਰ ਮਾਤਰਾ
ਸਾਪੇਖਿਕ ਮਾਤਰਾ ਨੂੰ ਮੁੱਖ ਤੌਰ 'ਤੇ ਵਿਗਿਆਨਕ ਖੋਜ ਵਿੱਚ ਵਰਤਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਖੂਨ ਦੇ 1ml ਵਿੱਚ ਕਿੰਨੇ ਵਾਇਰਸ ਹਨ, ਅਤੇ ਇਹ ਇੱਕ ਡੀਐਨਏ ਵਾਇਰਸ ਹੈ, ਇਹ ਇੱਕ ਮੁਕਾਬਲਤਨ ਨਿਰਣਾਇਕ ਘਟਨਾ ਹੈ: ਖੂਨ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤੀ ਜਾ ਸਕਦੀ ਹੈ, ਅਤੇ ਡੀਐਨਏ ਵਾਇਰਸ ਮੁਕਾਬਲਤਨ ਸਥਿਰ ਹੈ।ਹਾਲਾਂਕਿ, ਸਾਡੇ ਲਈ ਇੱਕ ਪੱਤੇ ਵਿੱਚ ਕਿਸੇ ਖਾਸ ਜੀਨ ਦੀਆਂ ਪ੍ਰਤੀਲਿਪੀ ਕਾਪੀਆਂ ਦੀ ਗਿਣਤੀ ਦੀ ਤੁਲਨਾ ਕਰਨਾ ਮੁਸ਼ਕਲ ਹੈ, ਕਿਉਂਕਿ ਪੱਤੇ ਦੇ ਆਕਾਰ, ਭਾਰ ਅਤੇ ਕੋਮਲਤਾ ਨੂੰ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨਾ ਮੁਸ਼ਕਲ ਹੈ, ਕੱਢੇ ਗਏ ਆਰਐਨਏ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨਾ ਮੁਸ਼ਕਲ ਹੈ, ਅਤੇ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਦੀ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਨੂੰ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨਾ ਵੀ ਮੁਸ਼ਕਲ ਹੈ, ਮਤਲਬ ਕਿ, ਕੋਈ ਵੀ ਕਦਮ ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਡੇਟਾ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਨਹੀਂ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ।
ਇਸ ਲਈ, ਸਾਪੇਖਿਕ ਮਾਤਰਾ ਨੂੰ ਇੱਕ ਤੱਤ ਪੇਸ਼ ਕਰਨਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ:ਅੰਦਰੂਨੀ ਹਵਾਲਾ ਜੀਨ.
ਦੂਜੇ ਸ਼ਬਦਾਂ ਵਿੱਚ, ਸਾਪੇਖਿਕ ਮਾਤਰਾ ਅਸਲ ਵਿੱਚ ਨਿਸ਼ਾਨਾ ਜੀਨ ਅਤੇ ਅੰਦਰੂਨੀ ਸੰਦਰਭ ਜੀਨ ਵਿਚਕਾਰ ਤੁਲਨਾ ਹੈ।ਇੱਕੋ ਟਿਸ਼ੂ ਅਤੇ ਇੱਕੋ ਸੈੱਲ ਦੀ ਤੁਲਨਾ ਵਿੱਚ, ਨਮੂਨੇ ਦਾ ਆਕਾਰ, ਆਰਐਨਏ ਕੱਢਣ ਦੀ ਮਾਤਰਾ, ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਕੁਸ਼ਲਤਾ, ਅਤੇ ਪੀਸੀਆਰ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਦਾ ਪ੍ਰਭਾਵ ਮੁਕਾਬਲਤਨ ਛੋਟਾ ਹੈ।ਛੋਟੇ ਨਮੂਨੇ ਦੇ ਆਕਾਰ ਦੇ ਕਾਰਨ, ਅੰਦਰੂਨੀ ਸੰਦਰਭ ਜੀਨ ਅਤੇ ਨਿਸ਼ਾਨਾ ਜੀਨ ਦੋਵੇਂ ਮੁਕਾਬਲਤਨ ਘਟੇ ਹੋਏ ਸਨ।ਇਸ ਲਈ ਅਸੀਂ ਪਹਿਲਾਂ ਵੀ ਇਕਸਾਰਤਾ ਅਤੇ ਸਥਿਰਤਾ 'ਤੇ ਜ਼ੋਰ ਦਿੰਦੇ ਰਹੇ ਹਾਂ।
ਅੰਦਰੂਨੀ ਸੰਦਰਭ ਜੀਨ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਹੁੰਦੇ ਹਨਹਾਊਸਕੀਪਿੰਗ ਜੀਨ(ਹਾਊਸ-ਕੀਪਿੰਗ ਜੀਨ), ਜੋ ਜੀਨਾਂ ਦੀ ਇੱਕ ਸ਼੍ਰੇਣੀ ਦਾ ਹਵਾਲਾ ਦਿੰਦੇ ਹਨ ਜੋ ਸਾਰੇ ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਸਥਿਰਤਾ ਨਾਲ ਪ੍ਰਗਟ ਕੀਤੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ, ਅਤੇ ਉਹਨਾਂ ਦੇ ਉਤਪਾਦ ਸੈੱਲਾਂ ਦੀਆਂ ਬੁਨਿਆਦੀ ਜੀਵਨ ਗਤੀਵਿਧੀਆਂ ਨੂੰ ਕਾਇਮ ਰੱਖਣ ਲਈ ਜ਼ਰੂਰੀ ਹੁੰਦੇ ਹਨ।
ਇਸ ਧਾਰਨਾ ਨੂੰ ਉਲਝਾਓ ਨਾ।ਹਾਊਸਕੀਪਿੰਗ ਜੀਨ ਜੈਵਿਕ ਫੰਕਸ਼ਨ ਸ਼ਬਦ ਹਨ, ਜਦੋਂ ਕਿ ਅੰਦਰੂਨੀ ਸੰਦਰਭ ਜੀਨ ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਤਕਨੀਕੀ ਸ਼ਬਦ ਹਨ।ਅੰਦਰੂਨੀ ਸੰਦਰਭ ਜੀਨਾਂ ਵਜੋਂ ਚੁਣੇ ਜਾਣ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ ਹਾਊਸਕੀਪਿੰਗ ਜੀਨਾਂ ਨੂੰ ਪ੍ਰਮਾਣਿਕਤਾ ਪਾਸ ਕਰਨ ਦੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ।
ਉਦਾਹਰਨ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਟਿਸ਼ੂ ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਉਹਨਾਂ ਦੇ ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਦੇ ਪੱਧਰਾਂ ਦੀ ਜਾਂਚ ਕਰਨ ਲਈ ਹੇਠਾਂ ਦਿੱਤੇ ਚਿੱਤਰ ਵਿੱਚ ਕਈ ਹਾਊਸਕੀਪਿੰਗ ਜੀਨਾਂ ਦੀ ਚੋਣ ਕੀਤੀ, ਅਤੇ ਪਾਇਆ ਕਿ β-2-ਮਾਈਕ੍ਰੋਗਲੋਬੂਲਿਨ ਦੇ ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਦੇ ਪੱਧਰ ਹੋਰ ਤਿੰਨ ਜੀਨਾਂ ਨਾਲੋਂ ਕਾਫ਼ੀ ਵੱਖਰੇ ਸਨ, ਇਸਲਈ ਉਹਨਾਂ ਨੂੰ ਅੰਦਰੂਨੀ ਸੰਦਰਭ ਜੀਨਾਂ ਵਜੋਂ ਨਹੀਂ ਵਰਤਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ।

ਅੰਦਰੂਨੀ ਸੰਦਰਭ ਜੀਨ ਦੇ ਸੁਧਾਰ ਕਾਰਜ ਨੂੰ ਸਮਝਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਅੰਦਰੂਨੀ ਸੰਦਰਭ ਜੀਨ ਦੀ ਸ਼ੁਰੂਆਤ ਦੇ ਕਾਰਨ ਦੋ ਐਲਗੋਰਿਦਮ ਬਣਾਏ ਗਏ ਹਨ।
· ਡਬਲ ਸਟੈਂਡਰਡ ਕਰਵ ਵਿਧੀ
·2 – △△Ct ਵਿਧੀ (CT ਮੁੱਲ ਤੁਲਨਾ ਵਿਧੀ)
ਜੇ ਤੁਸੀਂ ਸਪੀਸੀਜ਼ ਅਤੇ ਜੀਨ ਫੰਕਸ਼ਨਾਂ ਦਾ ਅਧਿਐਨ ਕਰਨ ਵਿੱਚ ਦਿਲਚਸਪੀ ਰੱਖਦੇ ਹੋ, ਤਾਂ ਕਿਰਪਾ ਕਰਕੇ ਐਲਗੋਰਿਦਮ 'ਤੇ ਖੋਜ ਨੂੰ ਛੱਡ ਦਿਓ ਅਤੇ ਸਿੱਧੇ ਫਾਰਮੂਲੇ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ, ਜਾਂ ਮਸ਼ੀਨਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ;ਜੇਕਰ ਤੁਸੀਂ ਗਣਿਤ ਅਤੇ ਇੰਜਨੀਅਰਿੰਗ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਸਿੱਧੇ ਵਿਅਕਤੀ ਹੋ, ਤਾਂ ਕਿਰਪਾ ਕਰਕੇ ਬੇਝਿਜਕ ਮਹਿਸੂਸ ਕਰੋ।
ਡਬਲ ਸਟੈਂਡਰਡ ਕਰਵ ਵਿਧੀ
ਨਿਯੰਤਰਣ ਨਮੂਨੇ ਦੇ ਟੀਚੇ ਦੇ ਜੀਨ ਅਤੇ ਹਾਊਸਕੀਪਿੰਗ ਜੀਨ ਅਤੇ ਮਿਆਰੀ ਕਰਵ ਦੁਆਰਾ ਟੈਸਟ ਕੀਤੇ ਜਾਣ ਵਾਲੇ ਨਮੂਨੇ ਦੀ ਮਿਣਤੀ ਕਰੋ, ਅਤੇ ਫਿਰ ਗਣਨਾ ਫਾਰਮੂਲੇ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ ਅਨੁਸਾਰੀ ਮੁੱਲ ਦੀ ਗਣਨਾ ਕਰੋ, ਜੋ ਕਿ ਸੰਬੰਧਿਤ ਸਮੀਕਰਨ ਪੱਧਰ ਹੈ।
ਫਾਇਦੇ: ਸਧਾਰਨ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ, ਮੁਕਾਬਲਤਨ ਸਧਾਰਨ ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਅਨੁਕੂਲਤਾ
ਨੁਕਸਾਨ: ਹਰੇਕ ਜੀਨ ਲਈ, ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਦੇ ਹਰੇਕ ਦੌਰ ਨੂੰ ਇੱਕ ਮਿਆਰੀ ਕਰਵ ਬਣਾਉਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ
ਐਪਲੀਕੇਸ਼ਨ: ਜੀਨ ਐਕਸਪ੍ਰੈਸ਼ਨ ਰੈਗੂਲੇਸ਼ਨ ਦੇ ਅਧਿਐਨ ਵਿੱਚ ਦੋ ਸਭ ਤੋਂ ਵੱਧ ਵਰਤੇ ਜਾਣ ਵਾਲੇ ਅਤੇ ਮਾਨਤਾ ਪ੍ਰਾਪਤ ਅਨੁਸਾਰੀ ਮਾਤਰਾਤਮਕ ਤਰੀਕਿਆਂ ਵਿੱਚੋਂ ਇੱਕ
ਫਾਰਮੂਲਾ ਇਸ ਪ੍ਰਕਾਰ ਹੈ:

ਉਦਾਹਰਨਾਂ ਇਸ ਪ੍ਰਕਾਰ ਹਨ:

ਮਾਤਰਾਤਮਕ ਨਤੀਜੇ ਦੇ ਆਧਾਰ 'ਤੇ ਸੰਬੰਧਿਤ ਰਕਮ ਦੀ ਗਣਨਾ ਕਰੋ
2 – △△Ct ਵਿਧੀ (CT ਮੁੱਲ ਤੁਲਨਾ ਵਿਧੀ)

ਫਾਇਦੇ: ਮਿਆਰੀ ਕਰਵ ਬਣਾਉਣ ਦੀ ਕੋਈ ਲੋੜ ਨਹੀਂ
ਨੁਕਸਾਨ: ਇਹ ਮੰਨਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਕੁਸ਼ਲਤਾ 100% ਦੇ ਨੇੜੇ ਹੈ;ਸਟੈਂਡਰਡ ਡਿਵੀਏਸ਼ਨ <5% ਹੈ, ਅਤੇ ਸਟੈਂਡਰਡ ਕਰਵ ਅਤੇ ਹਰੇਕ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਵਿਚਕਾਰ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਨੂੰ ਇਕਸਾਰ ਮੰਨਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ;ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਸਥਿਤੀਆਂ ਦਾ ਅਨੁਕੂਲਤਾ ਵਧੇਰੇ ਗੁੰਝਲਦਾਰ ਹੈ।
ਐਪਲੀਕੇਸ਼ਨ: ਜੀਨ ਐਕਸਪ੍ਰੈਸ਼ਨ ਰੈਗੂਲੇਸ਼ਨ ਦੇ ਅਧਿਐਨ ਵਿੱਚ ਦੋ ਸਭ ਤੋਂ ਵੱਧ ਵਰਤੇ ਜਾਣ ਵਾਲੇ ਅਤੇ ਮਾਨਤਾ ਪ੍ਰਾਪਤ ਅਨੁਸਾਰੀ ਮਾਤਰਾਤਮਕ ਤਰੀਕਿਆਂ ਵਿੱਚੋਂ ਇੱਕ

ਬੇਸ਼ੱਕ, ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਪੂਰੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਅਸੰਭਵ ਹੁੰਦੀ ਹੈ 1. ਸੁਧਾਰ ਵਿਧੀ: ਜੇਕਰ ਅਸੀਂ ਜਾਣਦੇ ਹਾਂ ਕਿ ਟੀਚਾ ਜੀਨ ਅਤੇ ਸੰਦਰਭ ਜੀਨ ਦੀ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਇੱਕੋ ਜਿਹੀ ਹੈ, ਪਰ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਕੁਸ਼ਲਤਾ 1 ਦੇ ਬਰਾਬਰ ਨਹੀਂ ਹੈ, ਤਾਂ 2－△△Ct ਨੂੰ ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ ਠੀਕ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ: (1+Efficiency－t, ਉਦਾਹਰਨ ਲਈ 1+E), 0.95 ਹੈ, ਫਿਰ ਗਣਨਾ ਫਾਰਮੂਲੇ ਨੂੰ 1.95－△△Ct ਤੱਕ ਠੀਕ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ
ਹੁਣ ਤੱਕ, ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਮਾਤਰਾਤਮਕ ਪੀਸੀਆਰ ਬਾਰੇ ਸਮੱਗਰੀ ਖਤਮ ਹੋ ਗਈ ਹੈ।