RT-qPCR ਨੂੰ ਸਾਧਾਰਨ PCR ਤਕਨਾਲੋਜੀ ਤੋਂ ਵਿਕਸਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ।ਇਹ ਰਵਾਇਤੀ ਪੀਸੀਆਰ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਪ੍ਰਣਾਲੀ ਵਿੱਚ ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਰਸਾਇਣਾਂ (ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਰੰਗ ਜਾਂ ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਪੜਤਾਲਾਂ) ਨੂੰ ਜੋੜਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਉਹਨਾਂ ਦੇ ਵੱਖੋ-ਵੱਖਰੇ ਲਿਊਮਿਨਸੈਂਟ ਵਿਧੀਆਂ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ ਅਸਲ ਸਮੇਂ ਵਿੱਚ ਪੀਸੀਆਰ ਐਨੀਲਿੰਗ ਅਤੇ ਐਕਸਟੈਂਸ਼ਨ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾਉਂਦਾ ਹੈ।ਮਾਧਿਅਮ ਵਿੱਚ ਫਲੋਰਸੈਂਟ ਸਿਗਨਲ ਤਬਦੀਲੀਆਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਪੀਸੀਆਰ ਦੇ ਹਰੇਕ ਚੱਕਰ ਵਿੱਚ ਉਤਪਾਦ ਤਬਦੀਲੀ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਦੀ ਗਣਨਾ ਕਰਨ ਲਈ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ।ਵਰਤਮਾਨ ਵਿੱਚ, ਸਭ ਤੋਂ ਆਮ ਤਰੀਕੇ ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਡਾਈ ਵਿਧੀ ਅਤੇ ਪੜਤਾਲ ਵਿਧੀ ਹਨ।

ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਡਾਈ ਵਿਧੀ:
ਕੁਝ ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਰੰਗ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ SYBR ਗ੍ਰੀਨ Ⅰ, ਪਿਕੋਗ੍ਰੀਨ, ਬੀਈਬੀਓ, ਆਦਿ, ਆਪਣੇ ਆਪ ਰੋਸ਼ਨੀ ਨਹੀਂ ਛੱਡਦੇ, ਪਰ dsDNA ਦੇ ਮਾਮੂਲੀ ਨਾਲੀ ਨਾਲ ਬੰਨ੍ਹਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਫਲੋਰੋਸੈੰਟ ਛੱਡਦੇ ਹਨ।ਇਸ ਲਈ, ਪੀਸੀਆਰ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਦੀ ਸ਼ੁਰੂਆਤ ਵਿੱਚ, ਮਸ਼ੀਨ ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਸਿਗਨਲ ਦਾ ਪਤਾ ਨਹੀਂ ਲਗਾ ਸਕਦੀ ਹੈ।ਜਦੋਂ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਐਨੀਲਿੰਗ-ਐਕਸਟੇਂਸ਼ਨ (ਦੋ-ਪੜਾਅ ਵਿਧੀ) ਜਾਂ ਐਕਸਟੈਂਸ਼ਨ ਪੜਾਅ (ਤਿੰਨ-ਪੜਾਅ ਵਿਧੀ) ਵੱਲ ਵਧਦੀ ਹੈ, ਤਾਂ ਇਸ ਸਮੇਂ ਡਬਲ ਸਟ੍ਰੈਂਡ ਖੋਲ੍ਹੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ, ਅਤੇ ਨਵੇਂ ਡੀਐਨਏ ਪੋਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਸਟ੍ਰੈਂਡ ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਦੇ ਦੌਰਾਨ, ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਅਣੂ dsDNA ਮਾਈਨਰ ਗਰੂਵ ਵਿੱਚ ਮਿਲਾਏ ਜਾਂਦੇ ਹਨ ਅਤੇ ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਫਲੋਰੇਸਿਕ ਨਿਕਲਦੇ ਹਨ।ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਪੀਸੀਆਰ ਚੱਕਰਾਂ ਦੀ ਗਿਣਤੀ ਵਧਦੀ ਹੈ, ਵੱਧ ਤੋਂ ਵੱਧ ਰੰਗ dsDNA ਨਾਲ ਮਿਲਦੇ ਹਨ, ਅਤੇ ਫਲੋਰੋਸੈੰਟ ਸਿਗਨਲ ਨੂੰ ਵੀ ਲਗਾਤਾਰ ਵਧਾਇਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਇੱਕ ਉਦਾਹਰਣ ਵਜੋਂ SYBR ਗ੍ਰੀਨ Ⅰ ਲਓ।
ਪੜਤਾਲ ਵਿਧੀ:
ਤਾਕਮਨ ਪੜਤਾਲ ਸਭ ਤੋਂ ਵੱਧ ਵਰਤੀ ਜਾਣ ਵਾਲੀ ਹਾਈਡੋਲਿਸਿਸ ਪੜਤਾਲ ਹੈ।ਪੜਤਾਲ ਦੇ 5′ ਸਿਰੇ 'ਤੇ ਇੱਕ ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਸਮੂਹ ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ FAM।ਪੜਤਾਲ ਆਪਣੇ ਆਪ ਵਿੱਚ ਨਿਸ਼ਾਨਾ ਜੀਨ ਲਈ ਇੱਕ ਕ੍ਰਮ ਪੂਰਕ ਹੈ।ਫਲੋਰੋਫੋਰ ਦੇ 3′ ਸਿਰੇ 'ਤੇ ਇੱਕ ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਬੁਝਾਉਣ ਵਾਲਾ ਸਮੂਹ ਹੁੰਦਾ ਹੈ।ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਰੈਜ਼ੋਨੈਂਸ ਐਨਰਜੀ ਟ੍ਰਾਂਸਫਰ (Förster resonance energy transfer, FRET) ਦੇ ਸਿਧਾਂਤ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ, ਜਦੋਂ ਰਿਪੋਟਰ ਫਲੋਰੋਸੈੰਟ ਸਮੂਹ (ਦਾਨੀ ਫਲੋਰੋਸੈੰਟ ਅਣੂ) ਅਤੇ ਬੁਝਾਉਣ ਵਾਲਾ ਫਲੋਰੋਸੈੰਟ ਸਮੂਹ (ਸਵੀਕਾਰ ਕਰਨ ਵਾਲਾ ਫਲੋਰੋਸੈੰਟ ਅਣੂ) ਜਦੋਂ ਐਕਸਾਈਟੇਸ਼ਨ ਸਪੈਕਟ੍ਰਮ ਓਵਰਲੈਪ ਹੋ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਦੂਰੀ ਦੇ ਬਹੁਤ ਨੇੜੇ ਹੋ ਸਕਦੀ ਹੈ, ਤਾਂ ਐਕਸਟੇਸ਼ਨ ਮੋਲੀਕਿਊਲ (ਐਕਸਸੀਟ) ਦੇ ਬਹੁਤ ਨੇੜੇ ਹੋ ਸਕਦਾ ਹੈ। ਸਵੀਕਾਰ ਕਰਨ ਵਾਲੇ ਅਣੂ ਦਾ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ, ਜਦੋਂ ਕਿ ਆਟੋਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਕਮਜ਼ੋਰ ਹੁੰਦਾ ਹੈ।ਇਸ ਲਈ, ਪੀਸੀਆਰ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਦੀ ਸ਼ੁਰੂਆਤ ਵਿੱਚ, ਜਦੋਂ ਜਾਂਚ ਸਿਸਟਮ ਵਿੱਚ ਸੁਤੰਤਰ ਅਤੇ ਬਰਕਰਾਰ ਹੁੰਦੀ ਹੈ, ਤਾਂ ਰਿਪੋਰਟਰ ਫਲੋਰੋਸੈੰਟ ਗਰੁੱਪ ਫਲੋਰੋਸੈੰਟ ਨਹੀਂ ਛੱਡੇਗਾ।ਐਨੀਲਿੰਗ ਕਰਨ ਵੇਲੇ, ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਅਤੇ ਪੜਤਾਲ ਟੈਂਪਲੇਟ ਨਾਲ ਜੁੜ ਜਾਂਦੇ ਹਨ।ਐਕਸਟੈਂਸ਼ਨ ਪੜਾਅ ਦੇ ਦੌਰਾਨ, ਪੌਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਲਗਾਤਾਰ ਨਵੀਆਂ ਚੇਨਾਂ ਦਾ ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਕਰਦਾ ਹੈ।ਡੀਐਨਏ ਪੋਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਵਿੱਚ 5′-3′ ਐਕਸੋਨੁਕਲੀਜ਼ ਗਤੀਵਿਧੀ ਹੁੰਦੀ ਹੈ।ਜਾਂਚ ਤੱਕ ਪਹੁੰਚਣ 'ਤੇ, ਡੀਐਨਏ ਪੋਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਟੈਂਪਲੇਟ ਤੋਂ ਜਾਂਚ ਨੂੰ ਹਾਈਡ੍ਰੋਲਾਈਜ਼ ਕਰੇਗਾ, ਰਿਪੋਰਟਰ ਫਲੋਰੋਸੈੰਟ ਗਰੁੱਪ ਨੂੰ ਕਵੇਨਚਰ ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਗਰੁੱਪ ਤੋਂ ਵੱਖ ਕਰੇਗਾ, ਅਤੇ ਫਲੋਰੋਸੈੰਟ ਸਿਗਨਲ ਜਾਰੀ ਕਰੇਗਾ।ਕਿਉਂਕਿ ਜਾਂਚ ਅਤੇ ਟੈਂਪਲੇਟ ਵਿਚਕਾਰ ਇੱਕ-ਨਾਲ-ਇੱਕ ਸਬੰਧ ਹੈ, ਜਾਂਚ ਦੀ ਸ਼ੁੱਧਤਾ ਅਤੇ ਸੰਵੇਦਨਸ਼ੀਲਤਾ ਦੇ ਮਾਮਲੇ ਵਿੱਚ ਜਾਂਚ ਵਿਧੀ ਡਾਈ ਵਿਧੀ ਨਾਲੋਂ ਉੱਤਮ ਹੈ।

ਚਿੱਤਰ 1 qRT-PCR ਦਾ ਸਿਧਾਂਤ

ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਡਿਜ਼ਾਈਨ
ਅਸੂਲ:

ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਨੂੰ ਨਿਊਕਲੀਕ ਐਸਿਡ ਲੜੀ ਦੇ ਸੁਰੱਖਿਅਤ ਖੇਤਰ ਵਿੱਚ ਡਿਜ਼ਾਇਨ ਕੀਤਾ ਜਾਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਉਹਨਾਂ ਦੀ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਹੋਣੀ ਚਾਹੀਦੀ ਹੈ।

cDNA ਕ੍ਰਮ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਨਾ ਸਭ ਤੋਂ ਵਧੀਆ ਹੈ, ਅਤੇ mRNA ਕ੍ਰਮ ਵੀ ਸਵੀਕਾਰਯੋਗ ਹੈ।ਜੇ ਨਹੀਂ, ਤਾਂ ਡੀਐਨਏ ਕ੍ਰਮ ਦੇ ਸੀਡੀਐਸ ਖੇਤਰ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾਓ।
ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਮਾਤਰਾਤਮਕ ਉਤਪਾਦ ਦੀ ਲੰਬਾਈ 80-150bp ਹੈ, ਸਭ ਤੋਂ ਲੰਬੀ 300bp ਹੈ, ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਦੀ ਲੰਬਾਈ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ 17-25 ਬੇਸਾਂ ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਹੁੰਦੀ ਹੈ, ਅਤੇ ਅੱਪਸਟ੍ਰੀਮ ਅਤੇ ਡਾਊਨਸਟ੍ਰੀਮ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਵਿਚਕਾਰ ਅੰਤਰ ਬਹੁਤ ਵੱਡਾ ਨਹੀਂ ਹੋਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ।

G+C ਸਮੱਗਰੀ 40% ਅਤੇ 60% ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਹੈ, ਅਤੇ 45-55% ਸਭ ਤੋਂ ਵਧੀਆ ਹੈ।
TM ਮੁੱਲ 58-62 ਡਿਗਰੀ ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਹੈ।
ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਡਾਈਮਰਾਂ ਅਤੇ ਸਵੈ-ਡਾਇਮਰਾਂ ਤੋਂ ਬਚਣ ਦੀ ਕੋਸ਼ਿਸ਼ ਕਰੋ, (ਲਗਾਤਾਰ ਪੂਰਕ ਬੇਸਾਂ ਦੇ 4 ਜੋੜਿਆਂ ਤੋਂ ਵੱਧ ਨਾ ਦਿਸਣ) ਹੇਅਰਪਿਨ ਬਣਤਰ, ਜੇਕਰ ਅਟੱਲ ਹੈ, ਤਾਂ ΔG<4.5kJ/mol* ਬਣਾਓ ਜੇਕਰ ਤੁਸੀਂ ਇਹ ਯਕੀਨੀ ਨਹੀਂ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹੋ ਕਿ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਦੌਰਾਨ gDNA ਨੂੰ ਹਟਾ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਹੈ, ਤਾਂ ਇੰਟ੍ਰੋਨ ਦੇ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਨੂੰ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਕਰਨਾ ਸਭ ਤੋਂ ਵਧੀਆ ਹੈ, GAT ਮੋਡ ਤੋਂ ਬਚਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ, GAT ′ ਮੋਡ ਖੇਤਰ ਤੋਂ ਪਰਹੇਜ਼ ਨਹੀਂ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ। /C, A/G ਨਿਰੰਤਰ ਬਣਤਰ (2-3) ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਅਤੇ ਗੈਰ-
ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਵਿਭਿੰਨਤਾ ਨਾਲ ਵਧੇ ਹੋਏ ਕ੍ਰਮ ਦੀ ਸਮਰੂਪਤਾ ਤਰਜੀਹੀ ਤੌਰ 'ਤੇ 70% ਤੋਂ ਘੱਟ ਹੈ ਜਾਂ ਇਸ ਵਿੱਚ 8 ਪੂਰਕ ਅਧਾਰ ਸਮਰੂਪਤਾ ਹੈ।
ਡਾਟਾਬੇਸ:
ਕੀਵਰਡਸ ਦੁਆਰਾ CottonFGD ਖੋਜ
ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਡਿਜ਼ਾਈਨ:
IDT-qPCR ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਡਿਜ਼ਾਈਨ

Fig2 IDT ਔਨਲਾਈਨ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਟੂਲ ਪੰਨਾ

Fig3 ਨਤੀਜਾ ਪੇਜ ਡਿਸਪਲੇ
lncRNA ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਦਾ ਡਿਜ਼ਾਈਨ:
lncRNA:mRNA ਦੇ ਸਮਾਨ ਕਦਮ।
miRNA:ਸਟੈਮ-ਲੂਪ ਵਿਧੀ ਦਾ ਸਿਧਾਂਤ: ਕਿਉਂਕਿ ਸਾਰੇ miRNAs ਲਗਭਗ 23 nt ਦੇ ਛੋਟੇ ਕ੍ਰਮ ਹਨ, ਇਸ ਲਈ ਸਿੱਧੀ ਪੀਸੀਆਰ ਖੋਜ ਨਹੀਂ ਕੀਤੀ ਜਾ ਸਕਦੀ, ਇਸਲਈ ਸਟੈਮ-ਲੂਪ ਕ੍ਰਮ ਟੂਲ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ।ਸਟੈਮ-ਲੂਪ ਕ੍ਰਮ ਲਗਭਗ 50 nt ਦਾ ਇੱਕ ਸਿੰਗਲ-ਸਟ੍ਰੈਂਡਡ ਡੀਐਨਏ ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਜੋ ਆਪਣੇ ਆਪ ਇੱਕ ਵਾਲਪਿਨ ਬਣਤਰ ਬਣਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।3 'ਅੰਤ ਨੂੰ miRNA ਅੰਸ਼ਕ ਟੁਕੜੇ ਦੇ ਪੂਰਕ ਕ੍ਰਮ ਦੇ ਤੌਰ 'ਤੇ ਡਿਜ਼ਾਇਨ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਫਿਰ ਟਾਰਗੇਟ miRNA ਨੂੰ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਦੇ ਦੌਰਾਨ ਸਟੈਮ-ਲੂਪ ਕ੍ਰਮ ਨਾਲ ਜੋੜਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਕੁੱਲ ਲੰਬਾਈ 70bp ਤੱਕ ਪਹੁੰਚ ਸਕਦੀ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ qPCR ਦੁਆਰਾ ਨਿਰਧਾਰਤ ਐਂਪਲੀਫਾਈਡ ਉਤਪਾਦ ਦੀ ਲੰਬਾਈ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ ਹੈ।ਟੇਲਿੰਗ miRNA ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਡਿਜ਼ਾਈਨ
ਵਿਸਤਾਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਖੋਜ:
ਔਨਲਾਈਨ ਬਲਾਸਟ ਡੇਟਾਬੇਸ: ਕ੍ਰਮ ਸਮਾਨਤਾ ਦੁਆਰਾ CottonFGD ਧਮਾਕਾ
ਲੋਕਲ ਬਲਾਸਟ: ਲੋਕਲ ਬਲਾਸਟ ਕਰਨ ਲਈ ਬਲਾਸਟ+ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਨ ਦਾ ਹਵਾਲਾ ਦਿਓ, ਲਿਨਕਸ ਅਤੇ ਮੈਕੋਸ ਸਿੱਧੇ ਤੌਰ 'ਤੇ ਸਥਾਨਕ ਡਾਟਾਬੇਸ ਸਥਾਪਤ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹਨ, ਉਬੰਟੂ ਬੈਸ਼ ਨੂੰ ਸਥਾਪਤ ਕਰਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਵੀ ਵਿਨ 10 ਸਿਸਟਮ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਸਥਾਨਕ ਧਮਾਕੇ ਦਾ ਡੇਟਾਬੇਸ ਅਤੇ ਸਥਾਨਕ ਧਮਾਕਾ ਬਣਾਓ;Win10 'ਤੇ ਉਬੰਟੂ ਬੈਸ਼ ਖੋਲ੍ਹੋ।
ਨੋਟਿਸ: ਉਪਰਲੇ ਕਪਾਹ ਅਤੇ ਸਮੁੰਦਰੀ ਟਾਪੂ ਕਪਾਹ ਟੈਟਰਾਪਲੋਇਡ ਫਸਲਾਂ ਹਨ, ਇਸਲਈ ਧਮਾਕੇ ਦਾ ਨਤੀਜਾ ਅਕਸਰ ਦੋ ਜਾਂ ਵੱਧ ਮੈਚ ਹੋਵੇਗਾ।ਅਤੀਤ ਵਿੱਚ, ਧਮਾਕੇ ਕਰਨ ਲਈ ਇੱਕ ਡੇਟਾਬੇਸ ਦੇ ਤੌਰ ਤੇ NAU cds ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਨ ਨਾਲ ਸਿਰਫ ਕੁਝ SNP ਅੰਤਰਾਂ ਵਾਲੇ ਦੋ ਸਮਰੂਪ ਜੀਨਾਂ ਨੂੰ ਲੱਭਣ ਦੀ ਸੰਭਾਵਨਾ ਹੈ।ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਦੋ ਸਮਰੂਪ ਜੀਨਾਂ ਨੂੰ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਦੁਆਰਾ ਵੱਖ ਨਹੀਂ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ, ਇਸਲਈ ਉਹਨਾਂ ਨੂੰ ਇੱਕੋ ਜਿਹਾ ਮੰਨਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਜੇਕਰ ਕੋਈ ਸਪੱਸ਼ਟ ਇੰਡੇਲ ਹੈ, ਤਾਂ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਇੰਡੇਲ 'ਤੇ ਡਿਜ਼ਾਇਨ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਪਰ ਇਸ ਨਾਲ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਦੀ ਸੈਕੰਡਰੀ ਬਣਤਰ ਹੋ ਸਕਦੀ ਹੈ ਮੁਫ਼ਤ ਊਰਜਾ ਵੱਧ ਜਾਂਦੀ ਹੈ, ਜਿਸ ਨਾਲ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਵਿੱਚ ਕਮੀ ਆਉਂਦੀ ਹੈ, ਪਰ ਇਹ ਅਟੱਲ ਹੈ।

ਪ੍ਰਾਇਮਰੀ ਸੈਕੰਡਰੀ ਬਣਤਰ ਦੀ ਖੋਜ:
ਕਦਮ:ਓਲੀਗੋ 7 → ਇਨਪੁਟ ਟੈਮਪਲੇਟ ਕ੍ਰਮ ਖੋਲ੍ਹੋ → ਉਪ-ਵਿੰਡੋ ਬੰਦ ਕਰੋ → ਸੇਵ ਕਰੋ → ਟੈਂਪਲੇਟ 'ਤੇ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਲੱਭੋ, ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਦੀ ਲੰਬਾਈ ਸੈੱਟ ਕਰਨ ਲਈ ctrl+D ਦਬਾਓ → ਵੱਖ-ਵੱਖ ਸੈਕੰਡਰੀ ਬਣਤਰਾਂ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕਰੋ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਸਵੈ-ਡਾਇਮੇਰਾਈਜ਼ੇਸ਼ਨ ਬਾਡੀ, ਹੇਟਰੋਡਾਈਮਰ, ਹੇਅਰਪਿਨ, ਮਿਸਮੈਚ, ਆਦਿ। ਚਿੱਤਰ 4 ਵਿੱਚ ਆਖਰੀ ਦੋ ਤਸਵੀਰਾਂ ਮੁੱਖ ਨਤੀਜੇ ਹਨ।ਫਰੰਟ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਦਾ ਨਤੀਜਾ ਚੰਗਾ ਹੈ, ਕੋਈ ਸਪੱਸ਼ਟ ਡਾਇਮਰ ਅਤੇ ਹੈਅਰਪਿਨ ਬਣਤਰ ਨਹੀਂ ਹੈ, ਕੋਈ ਨਿਰੰਤਰ ਪੂਰਕ ਬੇਸ ਨਹੀਂ ਹੈ, ਅਤੇ ਮੁਫਤ ਊਰਜਾ ਦਾ ਸੰਪੂਰਨ ਮੁੱਲ 4.5 ਤੋਂ ਘੱਟ ਹੈ, ਜਦੋਂ ਕਿ ਪਿਛਲਾ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਲਗਾਤਾਰ ਦਿਖਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ 6 ਬੇਸ ਪੂਰਕ ਹਨ, ਅਤੇ ਮੁਫਤ ਊਰਜਾ 8.8 ਹੈ;ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, 3′ ਸਿਰੇ 'ਤੇ ਇੱਕ ਹੋਰ ਗੰਭੀਰ ਡਾਈਮਰ ਦਿਖਾਈ ਦਿੰਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ 4 ਲਗਾਤਾਰ ਅਧਾਰਾਂ ਦਾ ਇੱਕ ਡਾਇਮਰ ਦਿਖਾਈ ਦਿੰਦਾ ਹੈ।ਹਾਲਾਂਕਿ ਮੁਫਤ ਊਰਜਾ ਜ਼ਿਆਦਾ ਨਹੀਂ ਹੈ, 3′ ਡਾਈਮਰ Chl ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਅਤੇ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਨੂੰ ਗੰਭੀਰਤਾ ਨਾਲ ਪ੍ਰਭਾਵਿਤ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਹੇਅਰਪਿਨ, ਹੇਟਰੋਡਾਈਮਰ ਅਤੇ ਬੇਮੇਲਾਂ ਦੀ ਜਾਂਚ ਕਰਨਾ ਜ਼ਰੂਰੀ ਹੈ।

Fig3 oligo7 ਖੋਜ ਨਤੀਜੇ
ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਖੋਜ:
ਪੀਸੀਆਰ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਦੀ ਵਿਸਤ੍ਰਿਤ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਪੀਸੀਆਰ ਨਤੀਜਿਆਂ ਨੂੰ ਗੰਭੀਰਤਾ ਨਾਲ ਪ੍ਰਭਾਵਿਤ ਕਰਦੀ ਹੈ।qRT-PCR ਵਿੱਚ ਵੀ, ਮਾਤਰਾਤਮਕ ਨਤੀਜਿਆਂ ਲਈ ਐਂਪਲੀਫੀਕੇਸ਼ਨ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਹੈ।ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਬਫਰ ਵਿੱਚ ਹੋਰ ਪਦਾਰਥਾਂ, ਮਸ਼ੀਨਾਂ ਅਤੇ ਪ੍ਰੋਟੋਕੋਲ ਨੂੰ ਹਟਾਓ।ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਦੀ ਗੁਣਵੱਤਾ ਦਾ qRT-PCR ਦੀ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਕੁਸ਼ਲਤਾ 'ਤੇ ਵੀ ਬਹੁਤ ਪ੍ਰਭਾਵ ਹੁੰਦਾ ਹੈ।ਨਤੀਜਿਆਂ ਦੀ ਸ਼ੁੱਧਤਾ ਨੂੰ ਯਕੀਨੀ ਬਣਾਉਣ ਲਈ, ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਦੀ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾਉਣ ਦੀ ਲੋੜ ਹੈ।ਇਹ ਮਾਨਤਾ ਪ੍ਰਾਪਤ ਹੈ ਕਿ ਪ੍ਰਭਾਵਸ਼ਾਲੀ qRT-PCR ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਕੁਸ਼ਲਤਾ 85% ਅਤੇ 115% ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਹੈ।ਦੋ ਤਰੀਕੇ ਹਨ:
1. ਮਿਆਰੀ ਕਰਵ ਵਿਧੀ:
aਸੀਡੀਐਨਏ ਨੂੰ ਮਿਲਾਓ
ਬੀ.ਗਰੇਡੀਐਂਟ ਪਤਲਾ
c.qPCR
d.ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਦੀ ਗਣਨਾ ਕਰਨ ਲਈ ਲੀਨੀਅਰ ਰਿਗਰੈਸ਼ਨ ਸਮੀਕਰਨ
2. LinRegPCR
LinRegPCR ਅਸਲ ਸਮੇਂ ਦੇ RT-PCR ਡੇਟਾ ਦੇ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਲਈ ਇੱਕ ਪ੍ਰੋਗਰਾਮ ਹੈ, ਜਿਸਨੂੰ SYBR ਗ੍ਰੀਨ ਜਾਂ ਸਮਾਨ ਰਸਾਇਣ ਦੇ ਅਧਾਰ ਤੇ ਮਾਤਰਾਤਮਕ PCR (qPCR) ਡੇਟਾ ਵੀ ਕਿਹਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਪ੍ਰੋਗਰਾਮ ਗੈਰ-ਬੇਸਲਾਈਨ ਸਹੀ ਕੀਤੇ ਡੇਟਾ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਹਰੇਕ ਨਮੂਨੇ 'ਤੇ ਵੱਖਰੇ ਤੌਰ 'ਤੇ ਬੇਸਲਾਈਨ ਸੁਧਾਰ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਇੱਕ ਵਿੰਡੋ-ਆਫ-ਲੀਨੀਅਰਿਟੀ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਫਿਰ PCR ਡੇਟਾ ਸੈੱਟ ਦੁਆਰਾ ਇੱਕ ਸਿੱਧੀ ਲਾਈਨ ਨੂੰ ਫਿੱਟ ਕਰਨ ਲਈ ਲੀਨੀਅਰ ਰੀਗਰੈਸ਼ਨ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦਾ ਹੈ।ਇਸ ਲਾਈਨ ਦੀ ਢਲਾਨ ਤੋਂ ਹਰੇਕ ਵਿਅਕਤੀਗਤ ਨਮੂਨੇ ਦੀ ਪੀਸੀਆਰ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਦੀ ਗਣਨਾ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ।ਔਸਤ ਪੀਸੀਆਰ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਪ੍ਰਤੀ ਐਂਪਲੀਕਨ ਅਤੇ ਪ੍ਰਤੀ ਨਮੂਨਾ Ct ਮੁੱਲ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਪ੍ਰਤੀ ਨਮੂਨੇ ਦੀ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਇਕਾਗਰਤਾ ਦੀ ਗਣਨਾ ਕਰਨ ਲਈ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ ਆਰਬਿਟਰਰੀ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਯੂਨਿਟਾਂ ਵਿੱਚ ਦਰਸਾਈ ਜਾਂਦੀ ਹੈ।ਡੇਟਾ ਇੰਪੁੱਟ ਅਤੇ ਆਉਟਪੁੱਟ ਇੱਕ ਐਕਸਲ ਸਪ੍ਰੈਡਸ਼ੀਟ ਦੁਆਰਾ ਹੁੰਦੇ ਹਨ।ਸਿਰਫ਼ ਨਮੂਨਾ
ਮਿਕਸਿੰਗ ਦੀ ਲੋੜ ਹੈ, ਕੋਈ ਗਰੇਡੀਐਂਟ ਨਹੀਂ
ਕਦਮ ਲੋੜੀਂਦੇ ਹਨ:(ਬੋਲੇ CFX96 ਨੂੰ ਉਦਾਹਰਣ ਵਜੋਂ ਲਓ, ਸਪਸ਼ਟ ABI ਵਾਲੀ ਮਸ਼ੀਨ ਨਹੀਂ)
ਪ੍ਰਯੋਗ:ਇਹ ਇੱਕ ਮਿਆਰੀ qPCR ਪ੍ਰਯੋਗ ਹੈ।
qPCR ਡਾਟਾ ਆਉਟਪੁੱਟ:LinRegPCR ਆਉਟਪੁੱਟ ਫਾਈਲਾਂ ਦੇ ਦੋ ਰੂਪਾਂ ਨੂੰ ਪਛਾਣ ਸਕਦਾ ਹੈ: RDML ਜਾਂ quantification Amplification ਨਤੀਜਾ।ਵਾਸਤਵ ਵਿੱਚ, ਇਹ ਮਸ਼ੀਨ ਦੁਆਰਾ ਚੱਕਰ ਨੰਬਰ ਅਤੇ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਸਿਗਨਲ ਦਾ ਅਸਲ-ਸਮੇਂ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾਉਣ ਵਾਲਾ ਮੁੱਲ ਹੈ, ਅਤੇ ਰੇਖਿਕ ਹਿੱਸੇ ਦੀ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਦੇ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਪਰਿਵਰਤਨ ਮੁੱਲ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕਰਕੇ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।
ਡਾਟਾ ਚੋਣ: ਸਿਧਾਂਤ ਵਿੱਚ, RDML ਮੁੱਲ ਵਰਤੋਂ ਯੋਗ ਹੋਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ।ਇਹ ਅੰਦਾਜ਼ਾ ਲਗਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ ਕਿ ਮੇਰੇ ਕੰਪਿਊਟਰ ਦੀ ਸਮੱਸਿਆ ਇਹ ਹੈ ਕਿ ਸੌਫਟਵੇਅਰ RDML ਨੂੰ ਪਛਾਣ ਨਹੀਂ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਇਸਲਈ ਮੇਰੇ ਕੋਲ ਮੂਲ ਡੇਟਾ ਦੇ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਐਕਸਲ ਆਉਟਪੁੱਟ ਮੁੱਲ ਹੈ।ਪਹਿਲਾਂ ਡੇਟਾ ਦੀ ਇੱਕ ਮੋਟਾ ਸਕ੍ਰੀਨਿੰਗ ਕਰਨ ਦੀ ਸਿਫਾਰਸ਼ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਨਮੂਨੇ ਸ਼ਾਮਲ ਕਰਨ ਵਿੱਚ ਅਸਫਲਤਾ, ਆਦਿ। ਆਉਟਪੁੱਟ ਡੇਟਾ ਵਿੱਚ ਪੁਆਇੰਟਾਂ ਨੂੰ ਮਿਟਾ ਦਿੱਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ (ਬੇਸ਼ਕ, ਤੁਸੀਂ ਉਹਨਾਂ ਨੂੰ ਨਹੀਂ ਮਿਟਾ ਸਕਦੇ, LinRegPCR ਬਾਅਦ ਦੇ ਪੜਾਅ ਵਿੱਚ ਇਹਨਾਂ ਬਿੰਦੂਆਂ ਨੂੰ ਨਜ਼ਰਅੰਦਾਜ਼ ਕਰ ਦੇਵੇਗਾ)

Fig5 qPCR ਡਾਟਾ ਨਿਰਯਾਤ

ਚਿੱਤਰ 6 ਉਮੀਦਵਾਰ ਦੇ ਨਮੂਨਿਆਂ ਦੀ ਚੋਣ

ਡਾਟਾ ਇਨਪੁਟ:ਓਪਨ ਯੋਗਤਾ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ results.xls, → ਓਪਨ LinRegPCR → ਫਾਈਲ → ਐਕਸਲ ਤੋਂ ਪੜ੍ਹੋ → ਚਿੱਤਰ 7 ਵਿੱਚ ਦਰਸਾਏ ਅਨੁਸਾਰ ਪੈਰਾਮੀਟਰ ਚੁਣੋ → ਠੀਕ ਹੈ → ਬੇਸਲਾਈਨ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰੋ ਤੇ ਕਲਿਕ ਕਰੋ

linRegPCR ਡੇਟਾ ਇਨਪੁਟ ਦੇ ਚਿੱਤਰ 7 ਪੜਾਅ

ਨਤੀਜਾ:ਜੇਕਰ ਕੋਈ ਦੁਹਰਾਓ ਨਹੀਂ ਹੈ, ਤਾਂ ਕਿਸੇ ਸਮੂਹ ਦੀ ਲੋੜ ਨਹੀਂ ਹੈ।ਜੇਕਰ ਦੁਹਰਾਓ ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਤਾਂ ਨਮੂਨਾ ਗਰੁੱਪਿੰਗ ਵਿੱਚ ਗਰੁੱਪਿੰਗ ਨੂੰ ਸੰਪਾਦਿਤ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਜੀਨ ਦਾ ਨਾਮ ਪਛਾਣਕਰਤਾ ਵਿੱਚ ਦਰਜ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਫਿਰ ਉਹੀ ਜੀਨ ਆਪਣੇ ਆਪ ਹੀ ਸਮੂਹਿਕ ਹੋ ਜਾਵੇਗਾ।ਅੰਤ ਵਿੱਚ, ਫਾਈਲ 'ਤੇ ਕਲਿੱਕ ਕਰੋ, ਐਕਸਲ ਐਕਸਪੋਰਟ ਕਰੋ ਅਤੇ ਨਤੀਜੇ ਵੇਖੋ।ਹਰੇਕ ਖੂਹ ਦੀ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਅਤੇ R2 ਨਤੀਜੇ ਪ੍ਰਦਰਸ਼ਿਤ ਕੀਤੇ ਜਾਣਗੇ।ਦੂਜਾ, ਜੇਕਰ ਤੁਸੀਂ ਸਮੂਹਾਂ ਵਿੱਚ ਵੰਡਦੇ ਹੋ, ਤਾਂ ਠੀਕ ਕੀਤੀ ਔਸਤ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਦਿਖਾਈ ਜਾਵੇਗੀ।ਯਕੀਨੀ ਬਣਾਓ ਕਿ ਹਰੇਕ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਦੀ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਕੁਸ਼ਲਤਾ 85% ਅਤੇ 115% ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਹੈ।ਜੇਕਰ ਇਹ ਬਹੁਤ ਵੱਡਾ ਜਾਂ ਬਹੁਤ ਛੋਟਾ ਹੈ, ਤਾਂ ਇਸਦਾ ਮਤਲਬ ਹੈ ਕਿ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਦੀ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਮਾੜੀ ਹੈ।

ਚਿੱਤਰ 8 ਨਤੀਜਾ ਅਤੇ ਡਾਟਾ ਆਉਟਪੁੱਟ

ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ:
RNA ਗੁਣਵੱਤਾ ਲੋੜਾਂ:
ਸ਼ੁੱਧਤਾ:1.72.0 ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਬਕਾਇਆ ਆਈਸੋਥੀਓਸਾਈਨੇਟ ਹੋ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਕਲੀਨ ਨਿਊਕਲੀਕ ਐਸਿਡ A260/A230 2 ਦੇ ਆਸ-ਪਾਸ ਹੋਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ ।ਜੇਕਰ 230 nm 'ਤੇ ਮਜ਼ਬੂਤ ​​ਸਮਾਈ ਹੁੰਦੀ ਹੈ, ਤਾਂ ਇਹ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਉੱਥੇ ਜੈਵਿਕ ਮਿਸ਼ਰਣ ਹਨ ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਫੀਨੇਟ ਆਇਨ।ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਇਸ ਨੂੰ 1.5% ਐਗਰੋਸ ਜੈੱਲ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਫੋਰੇਸਿਸ ਦੁਆਰਾ ਖੋਜਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਮਾਰਕਰ ਨੂੰ ਪੁਆਇੰਟ ਕਰੋ, ਕਿਉਂਕਿ ssRNA ਦਾ ਕੋਈ ਵਿਕਾਰ ਨਹੀਂ ਹੈ ਅਤੇ ਅਣੂ ਭਾਰ ਲਘੂਗਣਕ ਦਾ ਕੋਈ ਰੇਖਿਕ ਸਬੰਧ ਨਹੀਂ ਹੈ, ਅਤੇ ਅਣੂ ਭਾਰ ਨੂੰ ਸਹੀ ਢੰਗ ਨਾਲ ਦਰਸਾਇਆ ਨਹੀਂ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਇਕਾਗਰਤਾ: ਸਿਧਾਂਤਕ ਤੌਰ 'ਤੇਨਹੀਂ100ng/ul ਤੋਂ ਘੱਟ, ਜੇਕਰ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਬਹੁਤ ਘੱਟ ਹੈ, ਤਾਂ ਸ਼ੁੱਧਤਾ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਘੱਟ ਹੁੰਦੀ ਹੈ ਨਾ ਕਿ ਉੱਚੀ

Fig9 RNA ਜੈੱਲ

ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਜੇਕਰ ਨਮੂਨਾ ਕੀਮਤੀ ਹੈ ਅਤੇ RNA ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਉੱਚ ਹੈ, ਤਾਂ ਇਸ ਨੂੰ ਕੱਢਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਅਲੀਕੋਟ ਕਰਨ ਦੀ ਸਿਫਾਰਸ਼ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ, ਅਤੇ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਲਈ RNA ਨੂੰ 100-300ng/ul ਦੀ ਅੰਤਮ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਤੱਕ ਪਤਲਾ ਕਰਨ ਦੀ ਸਿਫਾਰਸ਼ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ।ਵਿੱਚਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਦੀ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ, ਜਦੋਂ mRNA ਨੂੰ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਓਲੀਗੋ (dt) ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਜੋ ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ ਪੌਲੀਏ ਟੇਲਾਂ ਨਾਲ ਬੰਨ੍ਹ ਸਕਦੇ ਹਨ ਉਲਟਾ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਲਈ ਵਰਤੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ, ਜਦੋਂ ਕਿ lncRNA ਅਤੇ circRNA ਕੁੱਲ RNA ਦੇ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਲਈ ਬੇਤਰਤੀਬ ਹੈਕਸਾਮਰ (ਰੈਂਡਮ 6 mer) ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹਨ miRNA ਲਈ, miRNA-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਟਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਲਈ miRNA-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਟਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਲਈ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਵਰਤੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ।ਕਈ ਕੰਪਨੀਆਂ ਨੇ ਹੁਣ ਸਪੈਸ਼ਲ ਟੇਲਿੰਗ ਕਿੱਟਾਂ ਲਾਂਚ ਕੀਤੀਆਂ ਹਨ।ਸਟੈਮ-ਲੂਪ ਵਿਧੀ ਲਈ, ਟੇਲਿੰਗ ਵਿਧੀ ਵਧੇਰੇ ਸੁਵਿਧਾਜਨਕ, ਉੱਚ-ਥਰੂਪੁੱਟ, ਅਤੇ ਰੀਐਜੈਂਟ-ਬਚਤ ਹੈ, ਪਰ ਇੱਕੋ ਪਰਿਵਾਰ ਦੇ miRNAs ਨੂੰ ਵੱਖ ਕਰਨ ਦਾ ਪ੍ਰਭਾਵ ਸਟੈਮ-ਲੂਪ ਵਿਧੀ ਜਿੰਨਾ ਵਧੀਆ ਨਹੀਂ ਹੋਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ।ਹਰੇਕ ਰਿਵਰਸ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਕਿੱਟ ਵਿੱਚ ਜੀਨ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ (ਸਟੈਮ-ਲੂਪਸ) ਦੀ ਇਕਾਗਰਤਾ ਲਈ ਲੋੜਾਂ ਹੁੰਦੀਆਂ ਹਨ।miRNA ਲਈ ਵਰਤਿਆ ਜਾਣ ਵਾਲਾ ਅੰਦਰੂਨੀ ਹਵਾਲਾ U6 ਹੈ।ਸਟੈਮ-ਲੂਪ ਇਨਵਰਸ਼ਨ ਦੀ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਵਿੱਚ, U6 ਦੀ ਇੱਕ ਟਿਊਬ ਨੂੰ ਵੱਖਰੇ ਤੌਰ 'ਤੇ ਉਲਟਾ ਦਿੱਤਾ ਜਾਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ U6 ਦੇ ਅਗਲੇ ਅਤੇ ਪਿਛਲੇ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਨੂੰ ਸਿੱਧੇ ਜੋੜਿਆ ਜਾਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ।circRNA ਅਤੇ lncRNA ਦੋਵੇਂ HKGs ਨੂੰ ਅੰਦਰੂਨੀ ਸੰਦਰਭ ਵਜੋਂ ਵਰਤ ਸਕਦੇ ਹਨ।ਵਿੱਚcDNA ਖੋਜ,
ਜੇਕਰ RNA ਨਾਲ ਕੋਈ ਸਮੱਸਿਆ ਨਹੀਂ ਹੈ, ਤਾਂ cDNA ਵੀ ਠੀਕ ਹੋਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ।ਹਾਲਾਂਕਿ, ਜੇਕਰ ਪ੍ਰਯੋਗ ਦੀ ਸੰਪੂਰਨਤਾ ਦਾ ਪਿੱਛਾ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਤਾਂ ਅੰਦਰੂਨੀ ਸੰਦਰਭ ਜੀਨ (ਰੈਫਰੈਂਸ ਜੀਨ, ਆਰਜੀ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਨਾ ਸਭ ਤੋਂ ਵਧੀਆ ਹੈ ਜੋ cds ਤੋਂ gDNA ਨੂੰ ਵੱਖ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਆਰਜੀ ਇੱਕ ਹਾਊਸਕੀਪਿੰਗ ਜੀਨ ਹੈ।, HKG) ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਚਿੱਤਰ 10 ਵਿੱਚ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ;ਉਸ ਸਮੇਂ, ਮੈਂ ਸੋਇਆਬੀਨ ਸਟੋਰੇਜ਼ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਬਣਾ ਰਿਹਾ ਸੀ, ਅਤੇ ਅੰਦਰੂਨੀ ਸੰਦਰਭ ਦੇ ਤੌਰ 'ਤੇ ਅੰਦਰੂਨੀ ਸੰਦਰਭ ਦੇ ਤੌਰ 'ਤੇ ਐਕਟਿਨ 7 ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ।gDNA ਵਿੱਚ ਇਸ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਦੇ ਐਂਪਲੀਫਾਈਡ ਟੁਕੜੇ ਦਾ ਆਕਾਰ 452bp ਸੀ, ਅਤੇ ਜੇਕਰ cDNA ਨੂੰ ਟੈਂਪਲੇਟ ਵਜੋਂ ਵਰਤਿਆ ਗਿਆ ਸੀ, ਤਾਂ ਇਹ 142bp ਸੀ।ਫਿਰ ਟੈਸਟ ਦੇ ਨਤੀਜਿਆਂ ਨੇ ਪਾਇਆ ਕਿ cDNA ਦਾ ਹਿੱਸਾ ਅਸਲ ਵਿੱਚ gDNA ਦੁਆਰਾ ਦੂਸ਼ਿਤ ਸੀ, ਅਤੇ ਇਹ ਵੀ ਸਾਬਤ ਹੋਇਆ ਕਿ ਉਲਟ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਦੇ ਨਤੀਜੇ ਵਿੱਚ ਕੋਈ ਸਮੱਸਿਆ ਨਹੀਂ ਸੀ, ਅਤੇ ਇਸਨੂੰ PCR ਲਈ ਇੱਕ ਟੈਪਲੇਟ ਵਜੋਂ ਵਰਤਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਐਗਰੋਜ਼ ਜੈੱਲ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਫੋਰੇਸਿਸ ਨੂੰ ਸਿੱਧੇ cDNA ਨਾਲ ਚਲਾਉਣਾ ਬੇਕਾਰ ਹੈ, ਅਤੇ ਇਹ ਇੱਕ ਫੈਲਣ ਵਾਲਾ ਬੈਂਡ ਹੈ, ਜੋ ਯਕੀਨਨ ਨਹੀਂ ਹੈ।

ਚਿੱਤਰ 10 ਸੀਡੀਐਨਏ ਖੋਜ

qPCR ਸ਼ਰਤਾਂ ਦਾ ਨਿਰਧਾਰਨਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਕਿੱਟ ਦੇ ਪ੍ਰੋਟੋਕੋਲ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ ਕੋਈ ਸਮੱਸਿਆ ਨਹੀਂ ਹੈ, ਮੁੱਖ ਤੌਰ 'ਤੇ tm ਮੁੱਲ ਦੇ ਪੜਾਅ ਵਿੱਚ।ਜੇਕਰ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਦੇ ਦੌਰਾਨ ਕੁਝ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਚੰਗੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਡਿਜ਼ਾਈਨ ਨਹੀਂ ਕੀਤੇ ਗਏ ਹਨ, ਜਿਸ ਦੇ ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ tm ਮੁੱਲ ਅਤੇ ਸਿਧਾਂਤਕ 60° C ਵਿਚਕਾਰ ਇੱਕ ਵੱਡਾ ਅੰਤਰ ਹੈ, ਤਾਂ ਇਹ ਸਿਫ਼ਾਰਸ਼ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ ਕਿ cDNA ਨਮੂਨੇ ਮਿਲਾਏ ਜਾਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਦੇ ਨਾਲ ਇੱਕ ਗਰੇਡੀਐਂਟ PCR ਚਲਾਓ, ਅਤੇ TM ਮੁੱਲ ਦੇ ਤੌਰ 'ਤੇ ਬੈਂਡਾਂ ਤੋਂ ਬਿਨਾਂ ਤਾਪਮਾਨ ਨੂੰ ਸੈੱਟ ਕਰਨ ਤੋਂ ਬਚਣ ਦੀ ਕੋਸ਼ਿਸ਼ ਕਰੋ।

ਡਾਟਾ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ

ਪਰੰਪਰਾਗਤ ਰਿਸ਼ਤੇਦਾਰ ਫਲੋਰਸੈਂਸ ਮਾਤਰਾਤਮਕ ਪੀਸੀਆਰ ਪ੍ਰੋਸੈਸਿੰਗ ਵਿਧੀ ਮੂਲ ਰੂਪ ਵਿੱਚ 2 ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ ਹੈ-ΔΔCT.ਡਾਟਾ ਪ੍ਰੋਸੈਸਿੰਗ ਟੈਮਪਲੇਟ।

ਸੰਬੰਧਿਤ ਉਤਪਾਦ:

ਰੀਅਲ ਟਾਈਮ ਪੀਸੀਆਰ ਆਸਾਨ^TM -ਤਾਕਮਾਨ

ਰੀਅਲ ਟਾਈਮ ਪੀਸੀਆਰ ਆਸਾਨ^TM -ਸਾਈਬਰ ਗ੍ਰੀਨ ਆਈ

RT Easy I (ਪਹਿਲੇ ਸਟ੍ਰੈਂਡ cDNA ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਲਈ ਮਾਸਟਰ ਪ੍ਰੀਮਿਕਸ)

RT Easy II (qPCR ਲਈ ਪਹਿਲੇ ਸਟ੍ਰੈਂਡ cDNA ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਲਈ ਮਾਸਟਰ ਪ੍ਰੀਮਿਕਸ)