ਇਹ ਚੰਗੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਜਾਣਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਕੇਂਦਰੀ ਸਿਧਾਂਤ ਵਿੱਚ, ਆਰਐਨਏ ਡੀਐਨਏ ਅਤੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਸਮੀਕਰਨ ਵਿਚਕਾਰ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨਲ ਵਿਚੋਲੇ ਹੈ।ਡੀਐਨਏ ਦੀ ਖੋਜ ਦੀ ਤੁਲਨਾ ਵਿੱਚ, ਆਰਐਨਏ ਦੀ ਖੋਜ ਜੀਵਾਂ ਵਿੱਚ ਜੀਨ ਸਮੀਕਰਨ ਨੂੰ ਵਧੇਰੇ ਉਦੇਸ਼ਪੂਰਣ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਦਰਸਾ ਸਕਦੀ ਹੈ।RNA ਨੂੰ ਸ਼ਾਮਲ ਕਰਨ ਵਾਲੇ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ: qRT-PCR, RNA-Seq, ਅਤੇ ਫਿਊਜ਼ਨ ਜੀਨ ਖੋਜ, ਆਦਿ। ਖੁਦ RNA ਦੀਆਂ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾਵਾਂ ਦੇ ਆਧਾਰ 'ਤੇ (RNA ਦੀ ਸ਼ੂਗਰ ਰਿੰਗ ਵਿੱਚ DNA ਦੀ ਸ਼ੂਗਰ ਰਿੰਗ ਨਾਲੋਂ ਇੱਕ ਵਧੇਰੇ ਮੁਫਤ ਹਾਈਡ੍ਰੋਕਸਾਈਲ ਸਮੂਹ ਹੁੰਦਾ ਹੈ), ਵਾਤਾਵਰਣ ਵਿੱਚ ਵੱਡੀ ਗਿਣਤੀ ਵਿੱਚ RNases ਦੇ ਨਾਲ, RNA ਦਾ DNA ਨਾਲੋਂ ਜ਼ਿਆਦਾ ਅਸਥਿਰ ਅਤੇ ਡੀਗਰੇਡ ਹੋਣਾ ਆਸਾਨ ਹੁੰਦਾ ਹੈ।ਕੂੜਾ ਅੰਦਰ, ਕੂੜਾ ਬਾਹਰ, ਜੇ ਆਰਐਨਏ ਦੀ ਗੁਣਵੱਤਾ ਚੰਗੀ ਨਹੀਂ ਹੈ, ਤਾਂ ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਨਤੀਜੇ ਅਸੰਤੁਸ਼ਟੀਜਨਕ ਹੋਣੇ ਚਾਹੀਦੇ ਹਨ, ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ ਗਲਤ ਡੇਟਾ ਜਾਂ ਮਾੜੀ ਦੁਹਰਾਉਣਯੋਗਤਾ ਦੇ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਗਟ ਹੁੰਦੇ ਹਨ।ਇਸ ਲਈ, ਆਰਐਨਏ ਦੀ ਪ੍ਰੋਸੈਸਿੰਗ ਵੱਲ ਵਧੇਰੇ ਧਿਆਨ ਦਿੱਤਾ ਜਾਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਬਾਅਦ ਦੇ ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਡੇਟਾ ਦੀ ਸ਼ੁੱਧਤਾ ਅਤੇ ਸ਼ੁੱਧਤਾ ਨੂੰ ਯਕੀਨੀ ਬਣਾਉਣ ਲਈ ਗੁਣਵੱਤਾ ਨਿਯੰਤਰਣ ਦਾ ਲਿੰਕ ਵੀ ਵਧੇਰੇ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਹੈ।

ਆਰਐਨਏ ਦੇ ਗੁਣਵੱਤਾ ਨਿਯੰਤਰਣ ਲਈ, ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਹੇਠਾਂ ਦਿੱਤੇ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਵਰਤੇ ਜਾਂਦੇ ਤਰੀਕੇ ਹਨ:

• ਸਪੈਕਟ੍ਰੋਫੋਟੋਮੈਟਰੀ
• ਐਗਰੋਸ ਜੈੱਲ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਫੋਰੇਸਿਸ
• ਐਜੀਲੈਂਟ ਬਾਇਓ ਐਨਾਲਾਈਜ਼ਰ
• ਰੀਅਲ-ਟਾਈਮ ਫਲੋਰੋਸੈੰਟ ਮਾਤਰਾਤਮਕ ਪੀ.ਸੀ.ਆਰ
• ਕਿਊਬਿਟ ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਡਾਈ ਵਿਧੀ

01 ਸਪੈਕਟ੍ਰੋਫੋਟੋਮੈਟਰੀ

RNA ਕੋਲ ਦੋਹਰੇ ਬਾਂਡ ਹਨ ਅਤੇ 260nm ਦੀ ਤਰੰਗ-ਲੰਬਾਈ 'ਤੇ ਇੱਕ ਸੋਖਣ ਸਿਖਰ ਹੈ।ਲੈਂਬਰਟ-ਬੀਅਰ ਦੇ ਨਿਯਮ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ, ਅਸੀਂ 260nm 'ਤੇ ਸਮਾਈ ਪੀਕ ਤੋਂ RNA ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਦੀ ਗਣਨਾ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹਾਂ।ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਅਸੀਂ 260nm, 280nm ਅਤੇ 230nm ਸਮਾਈ ਦੀਆਂ ਚੋਟੀਆਂ ਦੇ ਅਨੁਪਾਤ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ RNA ਦੀ ਸ਼ੁੱਧਤਾ ਦੀ ਵੀ ਗਣਨਾ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹਾਂ।280nm ਅਤੇ 230nm ਕ੍ਰਮਵਾਰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਅਤੇ ਛੋਟੇ ਅਣੂਆਂ ਦੀ ਸਮਾਈ ਦੀਆਂ ਚੋਟੀਆਂ ਹਨ।ਯੋਗ RNA ਸ਼ੁੱਧਤਾ ਦਾ A260/A280 ਅਤੇ A260/A230 ਦਾ ਅਨੁਪਾਤ 2 ਤੋਂ ਵੱਧ ਹੋਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ। ਜੇਕਰ ਇਹ 2 ਤੋਂ ਘੱਟ ਹੈ, ਤਾਂ ਇਸਦਾ ਮਤਲਬ ਹੈ ਕਿ RNA ਨਮੂਨੇ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਜਾਂ ਛੋਟੇ ਅਣੂ ਦੀ ਗੰਦਗੀ ਹੈ ਅਤੇ ਇਸਨੂੰ ਦੁਬਾਰਾ ਸ਼ੁੱਧ ਕਰਨ ਦੀ ਲੋੜ ਹੈ।ਗੰਦਗੀ ਦੇ ਸਰੋਤ ਡਾਊਨਸਟ੍ਰੀਮ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਨੂੰ ਪ੍ਰਭਾਵਤ ਕਰਨਗੇ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਪੀਸੀਆਰ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਦੀ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਨੂੰ ਰੋਕਣਾ, ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਗਲਤ ਮਾਤਰਾਤਮਕ ਨਤੀਜੇ ਨਿਕਲਦੇ ਹਨ।RNA ਦੀ ਸ਼ੁੱਧਤਾ ਦਾ ਬਾਅਦ ਦੇ ਨਤੀਜਿਆਂ 'ਤੇ ਬਹੁਤ ਪ੍ਰਭਾਵ ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਇਸਲਈ ਸਪੈਕਟ੍ਰੋਫੋਟੋਮੈਟਰੀ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਨਿਊਕਲੀਕ ਐਸਿਡ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਦੇ ਪਹਿਲੇ ਪੜਾਅ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਲਾਜ਼ਮੀ ਗੁਣਵੱਤਾ ਨਿਯੰਤਰਣ ਲਿੰਕ ਹੈ।

ਚਿੱਤਰ 1. ਆਮ RNA/DNA ਸਮਾਈ ਸਪੈਕਟ੍ਰਮ

02 ਐਗਰੋਸ ਜੈੱਲ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਫੋਰੇਸਿਸ

ਸ਼ੁੱਧਤਾ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਆਰਐਨਏ ਦੀ ਇਕਸਾਰਤਾ ਵੀ ਆਰਐਨਏ ਦੀ ਗੁਣਵੱਤਾ ਦਾ ਨਿਰਣਾ ਕਰਨ ਲਈ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਸੂਚਕਾਂ ਵਿੱਚੋਂ ਇੱਕ ਹੈ।ਆਰਐਨਏ ਦੀ ਗਿਰਾਵਟ ਨਮੂਨੇ ਵਿੱਚ ਵੱਡੀ ਗਿਣਤੀ ਵਿੱਚ ਛੋਟੇ ਟੁਕੜਿਆਂ ਦੀ ਅਗਵਾਈ ਕਰੇਗੀ, ਇਸਲਈ RNA ਦੇ ਟੁਕੜਿਆਂ ਦੀ ਸੰਖਿਆ ਜੋ ਪ੍ਰਭਾਵਸ਼ਾਲੀ ਢੰਗ ਨਾਲ ਖੋਜੇ ਜਾ ਸਕਦੇ ਹਨ ਅਤੇ ਸੰਦਰਭ ਕ੍ਰਮ ਦੁਆਰਾ ਕਵਰ ਕੀਤੇ ਜਾ ਸਕਦੇ ਹਨ।1% ਐਗਰੋਸ ਜੈੱਲ 'ਤੇ ਕੁੱਲ RNA ਦੇ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਫੋਰਸਿਸ ਦੁਆਰਾ RNA ਦੀ ਇਕਸਾਰਤਾ ਦੀ ਜਾਂਚ ਕੀਤੀ ਜਾ ਸਕਦੀ ਹੈ।ਇਹ ਵਿਧੀ ਜੈੱਲ ਨੂੰ ਆਪਣੇ ਆਪ ਕੌਂਫਿਗਰ ਕਰ ਸਕਦੀ ਹੈ, ਜਾਂ ਇਕਸਾਰਤਾ ਜਾਂਚ ਲਈ ਪ੍ਰੀਫੈਬਰੀਕੇਟਿਡ E-Gel™ ਸਿਸਟਮ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰ ਸਕਦੀ ਹੈ।ਕੁੱਲ RNA ਦਾ 80% ਤੋਂ ਵੱਧ ਰਾਈਬੋਸੋਮਲ RNA ਹੈ, ਜਿਸਦਾ ਜ਼ਿਆਦਾਤਰ ਹਿੱਸਾ 28S ਅਤੇ 18S rRNA (ਥਣਧਾਰੀ ਪ੍ਰਣਾਲੀਆਂ ਵਿੱਚ) ਨਾਲ ਬਣਿਆ ਹੈ।ਚੰਗੀ ਕੁਆਲਿਟੀ RNA ਦੋ ਸਪੱਸ਼ਟ ਚਮਕਦਾਰ ਬਾਰ ਦਿਖਾਏਗੀ, ਜੋ ਕਿ ਕ੍ਰਮਵਾਰ 5 Kb ਅਤੇ 2 Kb 'ਤੇ 28S ਅਤੇ 18S ਚਮਕਦਾਰ ਬਾਰ ਹਨ, ਅਤੇ ਅਨੁਪਾਤ 2:1 ਦੇ ਨੇੜੇ ਹੋਵੇਗਾ।ਜੇਕਰ ਇਹ ਇੱਕ ਫੈਲਣ ਵਾਲੀ ਸਥਿਤੀ ਵਿੱਚ ਹੈ, ਤਾਂ ਇਸਦਾ ਮਤਲਬ ਹੈ ਕਿ RNA ਨਮੂਨਾ ਘਟਾਇਆ ਗਿਆ ਹੋ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ RNA ਦੀ ਗੁਣਵੱਤਾ ਦੀ ਹੋਰ ਜਾਂਚ ਕਰਨ ਲਈ ਬਾਅਦ ਵਿੱਚ ਵਰਣਿਤ ਢੰਗ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਨ ਦੀ ਸਿਫਾਰਸ਼ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ।

ਚਿੱਤਰ 2. ਐਗਰੋਸ ਜੈੱਲ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਫੋਰੇਸਿਸ 'ਤੇ ਡੀਗਰੇਡ (ਲੇਨ 2) ਅਤੇ ਬਰਕਰਾਰ ਆਰਐਨਏ (ਲੇਨ 3) ਦੀ ਤੁਲਨਾ

03 ਐਜੀਲੈਂਟ ਬਾਇਓ ਐਨਾਲਾਈਜ਼ਰ

ਉੱਪਰ ਦੱਸੇ ਗਏ ਐਗਰੋਜ਼ ਜੈੱਲ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਫੋਰੇਸਿਸ ਵਿਧੀ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਜੋ ਸਾਨੂੰ ਆਰਐਨਏ ਦੀ ਇਕਸਾਰਤਾ ਨੂੰ ਆਸਾਨੀ ਨਾਲ ਅਤੇ ਤੇਜ਼ੀ ਨਾਲ ਪਛਾਣਨ ਵਿੱਚ ਮਦਦ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਅਸੀਂ ਆਰਐਨਏ ਦੀ ਇਕਸਾਰਤਾ ਨੂੰ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨ ਲਈ ਐਜੀਲੈਂਟ ਬਾਇਓਐਨਲਾਈਜ਼ਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਵੀ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹਾਂ।ਇਹ RNA ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਅਤੇ ਇਕਸਾਰਤਾ ਦਾ ਮੁਲਾਂਕਣ ਕਰਨ ਲਈ ਮਾਈਕ੍ਰੋਫਲੂਇਡਿਕਸ, ਕੇਸ਼ੀਲੀ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਫੋਰੇਸਿਸ, ਅਤੇ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਦੇ ਸੁਮੇਲ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦਾ ਹੈ।ਆਰਐਨਏ ਨਮੂਨੇ ਦੇ ਪ੍ਰੋਫਾਈਲ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕਰਨ ਲਈ ਬਿਲਟ-ਇਨ ਐਲਗੋਰਿਦਮ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ, ਐਜੀਲੈਂਟ ਬਾਇਓਐਨਲਾਈਜ਼ਰ ਇੱਕ ਸੰਦਰਭ ਆਰਐਨਏ ਇਕਸਾਰਤਾ ਮੁੱਲ, ਆਰਐਨਏ ਇਕਸਾਰਤਾ ਨੰਬਰ (ਇਸ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਆਰਆਈਐਨ ਵਜੋਂ ਜਾਣਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ) [1] ਦੀ ਗਣਨਾ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ।RIN ਦਾ ਮੁੱਲ ਜਿੰਨਾ ਵੱਡਾ ਹੋਵੇਗਾ, RNA ਦੀ ਇਕਸਾਰਤਾ ਓਨੀ ਹੀ ਜ਼ਿਆਦਾ ਹੋਵੇਗੀ (1 ਬਹੁਤ ਹੀ ਘਟੀਆ ਹੈ, 10 ਸਭ ਤੋਂ ਵੱਧ ਸੰਪੂਰਨ ਹੈ)।RNA ਨੂੰ ਸ਼ਾਮਲ ਕਰਨ ਵਾਲੇ ਕੁਝ ਪ੍ਰਯੋਗ ਗੁਣਵੱਤਾ ਦੇ ਮੁਲਾਂਕਣ ਲਈ ਇੱਕ ਪੈਰਾਮੀਟਰ ਵਜੋਂ RIN ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਨ ਦਾ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦੇ ਹਨ।ਇੱਕ ਉਦਾਹਰਨ ਦੇ ਤੌਰ 'ਤੇ ਉੱਚ-ਥਰੂਪੁਟ ਸੀਕੁਐਂਸਿੰਗ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ (ਇਸਨੂੰ ਬਾਅਦ ਵਿੱਚ NGS ਕਿਹਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ) ਨੂੰ ਲੈ ਕੇ, Oncomine™ Human Immune Repertoire ਦੇ ਦਿਸ਼ਾ-ਨਿਰਦੇਸ਼, ਜੋ ਕਿ ਥਰਮੋ ਫਿਸ਼ਰ ਦੀ ਆਨਕੋਮਾਈਨ ਪੈਨਲ ਲੜੀ ਵਿੱਚ ਬੀ ਸੈੱਲ ਅਤੇ ਟੀ ​​ਸੈੱਲ ਐਂਟੀਜੇਨ ਰੀਸੈਪਟਰਾਂ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾਉਣ ਲਈ ਵਰਤਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦਾ ਹੈ ਕਿ RIN ਮੁੱਲਾਂ ਵਾਲੇ ਨਮੂਨੇ 4, ਐੱਫ ਤੋਂ ਵੱਧ ਪੜ੍ਹੇ ਜਾ ਸਕਦੇ ਹਨ ਅਤੇ 3 ਤੋਂ ਵੱਧ ਪ੍ਰਭਾਵੀ ਹੋ ਸਕਦੇ ਹਨ।ਵੱਖ-ਵੱਖ ਪੈਨਲਾਂ ਲਈ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਸਿਫ਼ਾਰਸ਼ ਕੀਤੀਆਂ ਰੇਂਜਾਂ ਹਨ, ਅਤੇ ਅਕਸਰ ਇੱਕ ਉੱਚ RIN ਵਧੇਰੇ ਪ੍ਰਭਾਵਸ਼ਾਲੀ ਡਾਟਾ ਲਿਆ ਸਕਦਾ ਹੈ।

ਚਿੱਤਰ 3, Oncomine™ ਮਨੁੱਖੀ ਇਮਿਊਨ ਰੀਪਰਟੋਇਰ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਵਿੱਚ, 4 ਤੋਂ ਵੱਧ RIN ਵਾਲੇ ਨਮੂਨੇ ਵਧੇਰੇ ਪ੍ਰਭਾਵਸ਼ਾਲੀ ਰੀਡ ਅਤੇ ਟੀ ​​ਸੈੱਲ ਕਲੋਨ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾ ਸਕਦੇ ਹਨ।【2】

ਹਾਲਾਂਕਿ, RIN ਮੁੱਲ ਦੀਆਂ ਵੀ ਕੁਝ ਸੀਮਾਵਾਂ ਹਨ।ਹਾਲਾਂਕਿ RIN ਦਾ NGS ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਡੇਟਾ ਦੀ ਗੁਣਵੱਤਾ ਨਾਲ ਉੱਚ ਸਬੰਧ ਹੈ, ਇਹ FFPE ਨਮੂਨਿਆਂ ਲਈ ਢੁਕਵਾਂ ਨਹੀਂ ਹੈ।FFPE ਨਮੂਨਿਆਂ ਦਾ ਲੰਬੇ ਸਮੇਂ ਤੋਂ ਰਸਾਇਣਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਇਲਾਜ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ, ਅਤੇ ਕੱਢੇ ਗਏ RNA ਦਾ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਮੁਕਾਬਲਤਨ ਘੱਟ RIN ਮੁੱਲ ਹੁੰਦਾ ਹੈ।ਹਾਲਾਂਕਿ, ਇਸਦਾ ਮਤਲਬ ਇਹ ਨਹੀਂ ਹੈ ਕਿ ਪ੍ਰਯੋਗ ਦਾ ਪ੍ਰਭਾਵੀ ਡੇਟਾ ਅਸੰਤੁਸ਼ਟੀਜਨਕ ਹੋਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ.FFPE ਨਮੂਨਿਆਂ ਦੀ ਗੁਣਵੱਤਾ ਦਾ ਸਹੀ ਮੁਲਾਂਕਣ ਕਰਨ ਲਈ, ਸਾਨੂੰ RIN ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ ਹੋਰ ਮਾਪਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਨ ਦੀ ਲੋੜ ਹੈ।RIN ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, Agilent bioanalyzer RNA ਗੁਣਵੱਤਾ ਦੇ ਮੁਲਾਂਕਣ ਪੈਰਾਮੀਟਰ ਵਜੋਂ DV200 ਮੁੱਲ ਦੀ ਵੀ ਗਣਨਾ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ।DV200 ਇੱਕ ਪੈਰਾਮੀਟਰ ਹੈ ਜੋ ਇੱਕ RNA ਨਮੂਨੇ ਵਿੱਚ 200 bp ਤੋਂ ਵੱਡੇ ਟੁਕੜਿਆਂ ਦੇ ਅਨੁਪਾਤ ਦੀ ਗਣਨਾ ਕਰਦਾ ਹੈ।DV200 RIN ਨਾਲੋਂ FFPE ਨਮੂਨੇ ਦੀ ਗੁਣਵੱਤਾ ਦਾ ਬਿਹਤਰ ਸੂਚਕ ਹੈ।ਐੱਫ.ਐੱਫ.ਪੀ.ਈ. ਦੁਆਰਾ ਕੱਢੇ ਗਏ ਆਰਐਨਏ ਲਈ, ਇਸਦਾ ਪ੍ਰਭਾਵਸ਼ਾਲੀ ਢੰਗ ਨਾਲ ਖੋਜੇ ਜਾ ਸਕਣ ਵਾਲੇ ਜੀਨਾਂ ਦੀ ਸੰਖਿਆ ਅਤੇ ਜੀਨਾਂ ਦੀ ਵਿਭਿੰਨਤਾ [3] ਨਾਲ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਸਬੰਧ ਹੈ।ਹਾਲਾਂਕਿ DV200 FFPE ਦੀ ਗੁਣਵੱਤਾ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾਉਣ ਵਿੱਚ ਕਮੀਆਂ ਨੂੰ ਪੂਰਾ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਪਰ Agilent bioanalyzer ਅਜੇ ਵੀ RNA ਨਮੂਨਿਆਂ ਵਿੱਚ ਗੁਣਵੱਤਾ ਦੀਆਂ ਸਮੱਸਿਆਵਾਂ ਦਾ ਵਿਆਪਕ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨਹੀਂ ਕਰ ਸਕਦਾ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਇਹ ਵੀ ਸ਼ਾਮਲ ਹੈ ਕਿ ਕੀ ਨਮੂਨਿਆਂ ਵਿੱਚ ਇਨਿਹਿਬਟਰ ਹਨ ਜਾਂ ਨਹੀਂ।ਇਨਿਹਿਬਟਰਜ਼ ਖੁਦ ਡਾਊਨਸਟ੍ਰੀਮ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਦੀ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਨੂੰ ਪ੍ਰਭਾਵਤ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹਨ ਅਤੇ ਉਪਯੋਗੀ ਡੇਟਾ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਨੂੰ ਘਟਾ ਸਕਦੇ ਹਨ।ਇਹ ਜਾਣਨ ਲਈ ਕਿ ਕੀ ਨਮੂਨੇ ਵਿੱਚ ਕੋਈ ਇਨਿਹਿਬਟਰ ਹੈ, ਅਸੀਂ ਅੱਗੇ ਦੱਸੇ ਗਏ ਰੀਅਲ-ਟਾਈਮ ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਮਾਤਰਾਤਮਕ PCR ਵਿਧੀ ਨੂੰ ਅਪਣਾ ਸਕਦੇ ਹਾਂ।

04 ਰੀਅਲ-ਟਾਈਮ ਫਲੋਰੋਸੈੰਟ ਮਾਤਰਾਤਮਕ ਪੀ.ਸੀ.ਆਰ

ਰੀਅਲ-ਟਾਈਮ ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਮਾਤਰਾਤਮਕ PCR ਵਿਧੀ ਨਮੂਨੇ ਵਿੱਚ ਨਾ ਸਿਰਫ਼ ਇਨਿਹਿਬਟਰਾਂ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾ ਸਕਦੀ ਹੈ, ਸਗੋਂ FFPE ਨਮੂਨੇ ਵਿੱਚ RNA ਦੀ ਗੁਣਵੱਤਾ ਨੂੰ ਵੀ ਸਹੀ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਦਰਸਾਉਂਦੀ ਹੈ।Agilent ਜੀਵ-ਵਿਗਿਆਨਕ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਕਾਂ ਦੀ ਤੁਲਨਾ ਵਿੱਚ, ਰੀਅਲ-ਟਾਈਮ ਫਲੋਰਸੈਂਸ ਮਾਤਰਾਤਮਕ ਯੰਤਰ ਉਹਨਾਂ ਦੇ ਵਿਆਪਕ ਉਪਯੋਗ ਦੇ ਕਾਰਨ ਪ੍ਰਮੁੱਖ ਜੈਵਿਕ ਪ੍ਰਯੋਗਸ਼ਾਲਾਵਾਂ ਵਿੱਚ ਵਧੇਰੇ ਪ੍ਰਸਿੱਧ ਹਨ।RNA ਨਮੂਨਿਆਂ ਦੀ ਗੁਣਵੱਤਾ ਦੀ ਜਾਂਚ ਕਰਨ ਲਈ, ਸਾਨੂੰ ਸਿਰਫ਼ ਅੰਦਰੂਨੀ ਸੰਦਰਭ ਜੀਨਾਂ ਲਈ ਪ੍ਰਾਈਮਰ ਪੜਤਾਲਾਂ ਖਰੀਦਣ ਜਾਂ ਤਿਆਰ ਕਰਨ ਦੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ GUSB (ਕੈਟ ਨੰ. Hs00939627)।ਪੂਰਨ ਮਾਤਰਾਤਮਕ ਪ੍ਰਯੋਗ ਕਰਨ ਲਈ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ, ਪੜਤਾਲਾਂ ਅਤੇ ਮਾਪਦੰਡਾਂ (ਜਾਣੀਆਂ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਦੇ ਕੁੱਲ RNA) ਦੇ ਇਸ ਸਮੂਹ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ, ਪ੍ਰਭਾਵਸ਼ਾਲੀ RNA ਟੁਕੜੇ ਦੀ ਇਕਾਗਰਤਾ ਨੂੰ RNA ਗੁਣਵੱਤਾ ਦੇ ਮੁਲਾਂਕਣ ਸਟੈਂਡਰਡ (ਛੋਟੇ ਲਈ ਫੰਕਸ਼ਨਲ RNA ਕੁਆਂਟੀਟੇਸ਼ਨ (FRQ)) ਵਜੋਂ ਗਿਣਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਇੱਕ NGS ਟੈਸਟ ਵਿੱਚ, ਅਸੀਂ ਪਾਇਆ ਕਿ RNA ਨਮੂਨਿਆਂ ਦੇ FRQ ਦਾ ਪ੍ਰਭਾਵੀ ਡੇਟਾ ਵਾਲੀਅਮ ਨਾਲ ਬਹੁਤ ਉੱਚਾ ਸਬੰਧ ਹੈ।0.2ng/uL FRQ ਤੋਂ ਵੱਧ ਸਾਰੇ ਨਮੂਨਿਆਂ ਲਈ, ਘੱਟੋ-ਘੱਟ 70% ਰੀਡਜ਼ ਪ੍ਰਭਾਵਸ਼ਾਲੀ ਢੰਗ ਨਾਲ ਸੰਦਰਭ ਕ੍ਰਮ (ਚਿੱਤਰ 4) ਨੂੰ ਕਵਰ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹਨ।

ਚਿੱਤਰ 4, ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਮਾਤਰਾਤਮਕ ਵਿਧੀ ਦੁਆਰਾ ਖੋਜੇ ਗਏ FRQ ਮੁੱਲ ਦਾ NGS ਪ੍ਰਯੋਗ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਾਪਤ ਪ੍ਰਭਾਵਸ਼ਾਲੀ ਡੇਟਾ ਨਾਲ ਬਹੁਤ ਉੱਚਾ ਸਬੰਧ (R2>0.9) ਹੈ।ਲਾਲ ਲਾਈਨ 0.2 ng/uL (log10 = -0.7) ਦੇ ਬਰਾਬਰ FRQ ਮੁੱਲ ਹੈ।【4】

FFPE ਨਮੂਨਿਆਂ 'ਤੇ ਲਾਗੂ ਹੋਣ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਅਸਲ-ਸਮੇਂ ਦੀ ਮਾਤਰਾਤਮਕ ਪੀਸੀਆਰ ਵਿਧੀ ਵੀ ਨਮੂਨਿਆਂ ਵਿੱਚ ਇਨਿਹਿਬਟਰਾਂ ਦੀ ਪ੍ਰਭਾਵਸ਼ਾਲੀ ਢੰਗ ਨਾਲ ਨਿਗਰਾਨੀ ਕਰ ਸਕਦੀ ਹੈ।ਅਸੀਂ ਅੰਦਰੂਨੀ ਸਕਾਰਾਤਮਕ ਨਿਯੰਤਰਣ (IPC) ਅਤੇ ਇਸ ਦੇ ਅਸੇ ਨਾਲ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਪ੍ਰਣਾਲੀ ਵਿੱਚ ਖੋਜੇ ਜਾਣ ਵਾਲੇ ਨਮੂਨੇ ਨੂੰ ਸ਼ਾਮਲ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹਾਂ, ਅਤੇ ਫਿਰ Ct ਮੁੱਲ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਨ ਲਈ ਫਲੋਰੋਸੈਂਸ ਮਾਤਰਾਕਰਨ ਕਰ ਸਕਦੇ ਹਾਂ।ਜੇਕਰ ਨੋ-ਨਮੂਨਾ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਵਿੱਚ Ct ਮੁੱਲ Ct ਮੁੱਲ ਤੋਂ ਪਿੱਛੇ ਰਹਿ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਤਾਂ ਇਹ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਨਮੂਨੇ ਵਿੱਚ ਇਨਿਹਿਬਟਰ ਮੌਜੂਦ ਹੈ ਅਤੇ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਵਿੱਚ ਐਂਪਲੀਫਿਕੇਸ਼ਨ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਨੂੰ ਰੋਕਦਾ ਹੈ।

05 ਕਿਊਬਿਟ ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਡਾਈ ਵਿਧੀ

ਕਿਊਬਿਟ ਫਲੋਰੋਮੀਟਰ ਨਿਊਕਲੀਕ ਐਸਿਡ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਅਤੇ ਸ਼ੁੱਧਤਾ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾਉਣ ਲਈ ਸਭ ਤੋਂ ਵੱਧ ਵਰਤਿਆ ਜਾਣ ਵਾਲਾ ਛੋਟਾ ਯੰਤਰ ਹੈ, ਜੋ ਚਲਾਉਣ ਲਈ ਆਸਾਨ ਹੈ ਅਤੇ ਲਗਭਗ ਹਰ ਅਣੂ ਜੀਵ ਵਿਗਿਆਨ ਪ੍ਰਯੋਗਸ਼ਾਲਾ ਵਿੱਚ ਮੌਜੂਦ ਹੈ।ਇਹ ਖੋਜਣ ਅਤੇ ਨਿਊਕਲੀਕ ਐਸਿਡ-ਬਾਈਡਿੰਗ ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਡਾਈ (ਕਿਊਬਿਟ ਖੋਜ ਰੀਐਜੈਂਟ) ਦੁਆਰਾ ਨਿਊਕਲੀਕ ਐਸਿਡ ਦੀ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਦੀ ਸਹੀ ਗਣਨਾ ਕਰਦਾ ਹੈ।ਕਿਊਬਿਟ ਵਿੱਚ ਉੱਚ ਸੰਵੇਦਨਸ਼ੀਲਤਾ ਅਤੇ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਇਹ ਆਰਐਨਏ ਨੂੰ pg/µL ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਤੱਕ ਸਹੀ ਢੰਗ ਨਾਲ ਮਾਪ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਨਿਊਕਲੀਕ ਐਸਿਡ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਨੂੰ ਸਹੀ ਢੰਗ ਨਾਲ ਮਾਪਣ ਦੀ ਜਾਣੀ-ਪਛਾਣੀ ਯੋਗਤਾ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਥਰਮੋ ਫਿਸ਼ਰ ਦਾ ਨਵੀਨਤਮ ਨਵਾਂ ਮਾਡਲ, ਕਿਊਬਿਟ 4.0, ਆਰਐਨਏ ਦੀ ਇਕਸਾਰਤਾ ਦਾ ਵੀ ਪਤਾ ਲਗਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।Qubit 4.0′s RNA ਖੋਜ ਪ੍ਰਣਾਲੀ (RNA IQ Assay) ਇੱਕੋ ਸਮੇਂ ਦੋ ਖਾਸ ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਰੰਗਾਂ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾ ਕੇ RNA ਦੀ ਇਕਸਾਰਤਾ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾਉਂਦੀ ਹੈ।ਇਹ ਦੋ ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਰੰਗ ਕ੍ਰਮਵਾਰ ਆਰਐਨਏ ਦੇ ਵੱਡੇ ਟੁਕੜਿਆਂ ਅਤੇ ਛੋਟੇ ਟੁਕੜਿਆਂ ਨਾਲ ਬੰਨ੍ਹ ਸਕਦੇ ਹਨ।ਇਹ ਦੋ ਫਲੋਰੋਸੈਂਟ ਰੰਗ ਨਮੂਨੇ ਵਿੱਚ ਆਰਐਨਏ ਦੇ ਵੱਡੇ ਟੁਕੜਿਆਂ ਦੇ ਅਨੁਪਾਤ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ, ਅਤੇ ਇਸ ਤੋਂ ਆਰਐਨਏ ਗੁਣਵੱਤਾ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਣ ਵਾਲੇ ਆਈਕਿਊ (ਇਕਸਾਰਤਾ ਅਤੇ ਗੁਣਵੱਤਾ) ਮੁੱਲ ਦੀ ਗਣਨਾ ਕੀਤੀ ਜਾ ਸਕਦੀ ਹੈ।IQ ਮੁੱਲ FFPE ਅਤੇ ਗੈਰ-FFPE ਨਮੂਨਿਆਂ ਦੋਵਾਂ 'ਤੇ ਲਾਗੂ ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਬਾਅਦ ਦੇ ਕ੍ਰਮ ਦੀ ਗੁਣਵੱਤਾ 'ਤੇ ਬਹੁਤ ਪ੍ਰਭਾਵ ਪਾਉਂਦਾ ਹੈ।NGS ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਨੂੰ ਇੱਕ ਉਦਾਹਰਨ ਵਜੋਂ ਲੈਂਦੇ ਹੋਏ, Ion torrent™ ਪਲੇਟਫਾਰਮ 'ਤੇ ਕੀਤੇ ਗਏ RNA-Seq ਟੈਸਟ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਵਿੱਚ, 4 ਤੋਂ ਵੱਧ IQ ਮੁੱਲਾਂ ਵਾਲੇ ਜ਼ਿਆਦਾਤਰ ਨਮੂਨਿਆਂ ਵਿੱਚ ਘੱਟੋ-ਘੱਟ 50% ਪ੍ਰਭਾਵੀ ਰੀਡਜ਼ ਸਨ (ਚਿੱਤਰ 5)।ਉੱਪਰ ਦੱਸੇ ਗਏ ਖੋਜ ਵਿਧੀਆਂ ਦੀ ਤੁਲਨਾ ਵਿੱਚ, ਕਿਊਬਿਟ ਆਈਕਿਊ ਅਸੇ ਨਾ ਸਿਰਫ਼ ਕੰਮ ਕਰਨ ਲਈ ਵਧੇਰੇ ਸੁਵਿਧਾਜਨਕ ਹੈ ਅਤੇ ਘੱਟ ਸਮਾਂ (ਪੰਜ ਮਿੰਟਾਂ ਦੇ ਅੰਦਰ) ਲੈਂਦਾ ਹੈ, ਪਰ ਇਹ ਮਾਪਿਆ ਪੈਰਾਮੀਟਰ IQ ਮੁੱਲ ਅਤੇ ਡਾਊਨਸਟ੍ਰੀਮ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਦੀ ਡਾਟਾ ਗੁਣਵੱਤਾ ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਇੱਕ ਵਧੀਆ ਸਬੰਧ ਵੀ ਹੈ।

ਚਿੱਤਰ 5, ਕਿਊਬਿਟ RNA IQ ਮੁੱਲ ਅਤੇ RNA-Seq ਦੇ ਮੈਪ ਕੀਤੇ ਰੀਡਜ਼ ਵਿਚਕਾਰ ਬਹੁਤ ਵਧੀਆ ਸਬੰਧ ਹੈ।【5】

ਉਪਰੋਕਤ ਜਾਣ-ਪਛਾਣ ਦੁਆਰਾ, ਮੇਰਾ ਮੰਨਣਾ ਹੈ ਕਿ ਹਰੇਕ ਨੂੰ ਵੱਖ-ਵੱਖ RNA ਗੁਣਵੱਤਾ ਨਿਯੰਤਰਣ ਵਿਧੀਆਂ ਦੀ ਕਾਫੀ ਸਮਝ ਹੈ।ਅਭਿਆਸ ਵਿੱਚ, ਤੁਸੀਂ ਚੁਣ ਸਕਦੇ ਹੋਨਮੂਨੇ ਦੀ ਕਿਸਮ ਅਤੇ ਮੌਜੂਦਾ ਯੰਤਰਾਂ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ ਅਨੁਸਾਰੀ ਵਿਧੀ।ਕੇਵਲ ਆਰਐਨਏ ਦੀ ਗੁਣਵੱਤਾ ਨੂੰ ਚੰਗੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਨਿਯੰਤਰਿਤ ਕਰਕੇ ਹੀ ਅਸੀਂ ਮਾੜੀ ਨਮੂਨੇ ਦੀ ਗੁਣਵੱਤਾ ਦੇ ਕਾਰਨ ਆਉਣ ਵਾਲੇ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਦੀ ਅਸਫਲਤਾ ਤੋਂ ਬਚ ਸਕਦੇ ਹਾਂ, ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ ਕੀਮਤੀ ਸਮਾਂ, ਊਰਜਾ ਅਤੇ ਲਾਗਤ ਦੀ ਬਚਤ ਹੁੰਦੀ ਹੈ।

ਸੰਦਰਭ ਉਤਪਾਦ:

ਜਾਨਵਰਾਂ ਦੀ ਕੁੱਲ RNA ਆਈਸੋਲੇਸ਼ਨ ਕਿੱਟ

ਸੈੱਲ ਕੁੱਲ RNA ਆਈਸੋਲੇਸ਼ਨ ਕਿੱਟ

ਹਵਾਲੇ

【1】ਸ਼੍ਰੋਡਰ, ਏ., ਮੂਲਰ, ਓ., ਸਟਾਕਰ, ਐਸ. ਅਤੇ ਹੋਰ।RIN: RNA ਮਾਪਾਂ ਨੂੰ ਇਕਸਾਰਤਾ ਮੁੱਲ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨ ਲਈ ਇੱਕ RNA ਇਕਸਾਰਤਾ ਨੰਬਰ।BMC ਮੋਲੀਕਿਊਲਰ ਬਾਇਓਲ 7, 3 (2006)।https:// doi .org/10.1186/1471-21 99-7-3

【2】ਆਨਕਮਾਈਨ ਹਿਊਮਨ ਇਮਿਊਨ ਰੀਪਰਟੋਇਰ ਯੂਜ਼ਰ ਗਾਈਡ (ਪਬ ਨੰ. MAN0017438 Rev. C.0)।

【3】ਲੇਹ ਸੀ ਵੇਹਮਾਸ, ਚਾਰਲਸ ਈ ਵੁੱਡ, ਬ੍ਰਾਇਨ ਐਨ ਚੋਰਲੇ, ਕੈਰੋਲ ਐਲ ਯੌਕ, ਗੇਲ ਐਮ ਨੈਲਸਨ, ਸੂਜ਼ਨ ਡੀ ਹੇਸਟਰ, ਆਰਕਾਈਵਲ ਫਾਰਮਲਿਨ-ਫਿਕਸਡ ਪੈਰਾਫਿਨ-ਏਮਬੈਡਡ ਟਿਸ਼ੂ ਨਮੂਨੇ, ਵੋਲਯੂਮ 201 ਵਿਗਿਆਨ, ਪੰਨਾ 201, ਪੁਰਾਲੇਖ ਤੋਂ ਪ੍ਰਾਪਤ ਆਰਐਨਏ ਦਾ ਮੁਲਾਂਕਣ ਕਰਨ ਲਈ ਵਿਸਤ੍ਰਿਤ ਗੁਣਵੱਤਾ ਮੈਟ੍ਰਿਕਸ 357-373,https://doi.org/10.1093/toxsci/